Molecularly imprinted polymeric nanoparticles for the therapeutic drug monitoring of anticancer drugs

Chemotherapy consists in cancer treatment by the administration of a single or a combination of anticancer drugs. However chemotherapy agents are often characterized by an high variability of pharmacokinetic among patients and an high toxicity that leads to the appearance of many side effects decreasing the therapy efficiency. Therefore the therapeutic drug monitoring (TDM) become useful to develop personalized therapies for patients in order to increase the efficiency of the therapy and patient compliance. This project is aimed on the synthesis and development of specific sensors based on molecularly imprinted polymeric nanoparticles, to be applied in TDM of the anticancer drugs: sunitinib, paclitaxel, SN38 and its prodrug irinotecan. Soluble nanoparticles were obtained by high dilution radical polymerization with different functional monomers: N-acryloyl-tyrosine methyl ester, N-acryloyl-tryptophan methyl ester, 4-vinyl pyridine or 7-acryloyloxy-coumarin. The reactions were carried out allowing the functional monomer to interact with the drug by weak interactions (H-bonds, -staking and Van der Waals) in DMSO and after the addition of the co-monomer acrylamide, the crosslinker N,N’-ethylene bisacrylamide, and the radical initiator azobisisobutyronitrile (AIBN) the polymerization was achieved heating at 70°C for 4 days. The template was removed by dialysis first in methanol:acetic acid mixture and after in water. After the freeze-drying the polymers were characterized by 1H-NMR, Nanosight, and Dynamic Laser Light Scattering. The polymers binding capabilities and selectivity were investigated by rebinding tests using an HPLC method for the quantification of drug captured. while the fluorescence properties of some of these polymers were exploited to study the polymers binding affinities at low drug concentrations. The polymer containing coumarin and imprinted with sunitinib was used as fluorescence sensor to set up a validation test in DMSO:plasma mixture. The system showed an accuracy of 15%, a precision of 10% and a good robustness. Two different fluorescence sensors were also developed for irinotecan able to quantify the drug in methanol:plasma mixtures. The first sensor is based on the quenching of the intrinsic fluorescence of irinotecan, while the second is an highly fluorescence polymer containing a functional monomer with a naphthalimide mojety whose fluorescence is quenched upon interaction with the drug. Moreover the dye displacement technique was used to set up a fluorescent and colorimetric test for paclitaxel quantification. The test is based on the competition between the free paclitaxel and the drug covalently linked to DABCYL dye, for the binding in to an imprinted polymer containing EDANS fluorescent functional monomer. Since DABCYL is both a red dye and a FRET quencher of EDANS, its binding into the polymer gives a change in the polymer fluorescence and colour. Finally a colorimetric test for irinotecan quantification was developed using an imprinted polymer containing 2-acrylamido-2-methylpropane sulfonic acid as functional monomer. The test is based on the binding of aniline yellow dye in to the remaining free binding sites of the polymer after treatment with drug samples. The interaction between the dye and the sulfonic acid in to the polymer gives a change of colour from yellow to red.

La chemoterapia consiste nell’impiego di uno o di una combinazione di farmaci antitumorali per il trattamento del cancro. Tuttavia tali farmaci sono caratterizzati da una famacocinetica molto variabile e da una elevata tossicità che porta alla comparsa di molti effetti indesiderati nei pazienti, diminuendo l’efficienza della terapia. In questo contesto l’impiego del “Therapeutic Drug Monitoring” (TDM) risulta particolarmente importante in quanto permette per lo sviluppo di terapie personalizzate per i pazienti aumentando l’efficienza della terapia e la qualità della vita dei pazienti. Questo progetto è finalizzato alla sintesi e allo sviluppo di sensori, basati su nanoparticelle polimeriche ad impronta molecolare, per i farmaci antitumorali: sunitinib, paclitaxel, SN38 e irinotecano, suo profarmaco. Tali nanoparticelle solubili sono state ottenute mediante polimerizzazione radicalica ad elevata diluizione utilizzando diversi monomeri funzionali: N-acriloil-tirosina metil estere, N-acriloil triptofano metil estere, 4-vinilpiridina e 7-acrilossicumarina. La reazione è stata effettuata lasciando interagire i monomeri funzionali e il farmaco mediante interazioni deboli (legami idrogeno, π-staking, interazioni di Van der Waals) in DMSO e dopo l’aggiunta dell’acrilamide come co-monomero, dell’N,N’-etilenebisacrilamide come crosslinker e dell’iniziatore radicalico azobisisobitironitrile (AIBN) la polimerizzazione è stata ottenuta scaldando a 70°C per 4 giorni. La molecola templato è stata rimossa mediante dialisi prima in una miscela di metanolo e acido acetico, e poi in acqua. Le particelle ottenute dopo liofilizzazione, sono state caratterizzate mediante 1H-NMR, Nanosigh e Dynamic Laser Ligh Scattering. La capacità di legame e la selettività dei polimeri è stata studiata mediante test di recupero utilizzando un metodo HPLC per la quantificazione del farmaco catturato. Mentre le proprietà fluorescenti di alcuni dei polimeri sintetizzati sono state utilizzate per studiare le affinità di legame dei polimeri a basse concentrazioni di farmaco. Il polimero contenente cumarina e specifico per il sunitinib è stato utilizzato come sensore fluorescente per lo sviluppo di un test di validazione in DMSO:plasma. Il sensore ha mostrato un’accuratezza del 15%, una precisione del 10% e una buona robustezza. Inoltre due diversi sensori fluorescenti sono stati sviluppati per la quantificazione dell’irinotecano in metanolo:plasma. Il primo sensore si basa sul quenching della fluorescenza intrinseca dell’irinotecano, mentre il secondo è un polimero molto fluorescente contenente un monomero funzionale con un gruppo naftalimidico la cui fluorescenza è spenta in seguito all’interazione con l’irinotecano. Inoltre un test fluorimetrico e colorimetrico è stato sviluppato per quantificare il paclitaxel mediante la tecnica del “dye displacement”. Il test infatti, si basa sulla competizione tra il farmaco libero ed il farmaco legato covalentemente al DABCYL per il legame ad un polimero ad imprinting molecolare contenente EDANS come monomero funzionale fluorescente. Infatti il DABCYL è sia un colorante rosso, sia un FRET quencher dell’EDANS, perciò il suo legame nel polimero porta ad una variazione del colore e della fluorescenza del polimero. Infine un test colorimetrico per la quantificazione dell’irinotecano è stato sviluppato utilizzando un polimero ad imprinting molecolare contenente l’acido 2-acrilamido-2-metil propansolfonico come monomero funzionale. Il test si basa sul legame del colorante: anilina gialla nei siti di legame del polimero rimasti liberi dopo interazione con i campioni di farmaco. L’interazione tra il colorante e l’acido solfonico nel polimero genera un cambio di colore da giallo a rosso.