Le colture organotipiche come nuovo modello per lo studio degli eventi molecolari coinvolti nel danno regionale selettivo al cervello della bilirubina.

Moderate unconjugated hyperbilirubinemia is a common condition in the first week of postnatal life. Some neonates may develop very high levels of unconjugated bilirubin (UCB), with an increase of the unbound free fraction (Bf), able to diffuse through the blood brain barrier. The clinical manifestations range from the less severe Bilirubin-Induced Neurological Damage (BIND) to a more severe chronic kernicterus. Neurological damage is characterized by variability in location and severity of symptoms, including: motor disorders and athetosis (basal ganglia and cerebellum), auditory dysfunction (inferior colliculus), memory and learning impairment (hippocampus). Amount and duration of hyperbilirubinemia are not the only parameters that influence the severity of the damages. The neurodevelopmental age at the time of insult exposition and a still unexplained selective regional brain sensitivity, seem to play an important role in influencing the damages. To investigate the reason(s) of this variability we developed organotypic brain cultures (OBCs), which preserve the architecture, cellular complexity and connection of the in vivo nervous tissue in an in vitro system. These characteristics allow the identification of the most sensible brain regions and CNS developmental stages to acute bilirubin toxicity. These data were used to evaluate alternative therapeutical strategies. Cortex (Ctx), Cerebellum (Cll), Hippocampus (Hip), Superior and Inferior collicula (SC, IC) OBCs from 2 (P2) and 8 (P8) days old rats, were produced and challenged with 70, 140 and 300nM Bf for 24Hrs. Membrane leakage, mitochondrial activity, apoptosis, glutamate excitotoxicity, inflammation, astrogliosis, oxidative stress were monitored. Finally anti-inflammatory, anti-oxidant and drugs inhibiting the glutamate channels, were screened for their ability to reverse the damage. We highlighted a differential developmental and regional sensitivity to bilirubin. Immediately after the birth (P2), Ctx displayed the maximal damage, followed by Hip and IC (starting from 140 nM Bf). In OBCs reproducing a more developed CNS (P8), sensitivity was increased. Surprisingly 70 nM Bf, usually considered safe, was able to induce damage in three regions (Hip, IC and Ctx). On the contrary, cerebellum was not damaged by bilirubin during treatment of 24 hours, while superior colliculus confirmed its resistance to bilirubin as expected by literature data. The Hip damage was mostly mediated by glutamate excitotoxicity and inflammation, with oxidative stress less relevant. In agreement, MgCl2 and indomethacin were more effective than curcumin, unable reverting damage to control levels. This objective was reached by exposing the OBC to a cocktail of the aforementioned molecules. IC showed a mechanism more related to inflammation and oxidative stress, efficiently reverted by curcumin and indomethacin. On the contrary, Ctx responded well to all therapeutic approach. Our data documented the existence of a regional and developmental differential sensitivity to bilirubin insults. Data reported suggest a complex, but somehow region-specific mechanisms of toxicity, significantly reverted by the drugs we tested. This work opens the way to a new therapeutical approach aimed in protect directly the brain.

L’ittero neonatale, caratterizzato da un moderato aumento della bilirubina sierica, è una condizione comune nel 60% dei neonati. Alcuni bambini possono sviluppare elevati livelli di bilirubina per un lungo periodo, favorendo l’aumento della concentrazione della frazione di bilirubina libera (Bf) non legata all’albumina e in grado di passare la barriera emato-encefalica. Il danno al cervello può essere limitato, come nell’encefalopatia da bilirubina, o progredire fino a livelli cronici e permanenti come nel kernittero. Il danno neurologico è variabile in base alla sede colpita e può interessare il comparto motorio (cervelletto), uditivo (collicoli inferiori) e cognitivo (ippocampo). Il livello di bilirubina totale e la durata dell’iperbilirubinemia sono parametri importanti per valutare la gravità della condizione patologica. In aggiunta, anche lo stadio di sviluppo del cervello dei bambini, specialmente nei prematuri, e una riportata ma ancor non spiegata differente sensibilità alla bilirubina di differenti regioni del cervello sono parametri che possono influenzare in modo rilevanti la severità e le manifestazioni cliniche della patologia. Per studiare il ruolo dello sviluppo e della differente sensibilità regionale del cervello, le colture organotipiche di cervello di ratto (che mantengono l’eterogeneità cellulare del tessuto, nella sua struttura e connettività 3D, ma che possono essere coltivate in vitro) sono state sviluppate e ottimizzate per lo studio della tossicità da bilirubina. Colture d’ippocampo, cervelletto, collicoli inferiore e superiore e corteccia provenienti da animali di due differenti fasi dello sviluppo post-natale (2 e 8 giorni dopo la nascita) sono state trattate con differenti concentrazioni di Bf (70, 140, 300 nM) per 24 ore. La vitalità, apoptosi, attività mitocondriale sono stati valutati per studiare la differente sensibilità delle colture. Il ruolo dello stress ossidativo, infiammazione, astrogliosi ed eccitotossicità è stato valutato per studiare i meccanismi coinvolti nel danno da bilirubina. I risultati ottenuti mostrano differenze nella sensibilità regionale e nello stadio di sviluppo. Corteccia, e meno collicoli inferiori e ippocampo sono state le regioni più sensibili nelle colture derivate da animali di 2 giorni a partire da una Bf di 140nM. Un incremento della sensibilità alla bilirubina è stato osservato nelle stesse regioni, con ippocampo il più danneggiato, in colture di animali di 8 giorni, dove anche la concentrazione di 70 nM, considerata moderata e non tossica, è stata in grado di causare danno. Diversamente da quanto ipotizzato, il cervelletto non ha mostrato un danno significativo da bilirubina, mentre i collicoli superiori hanno confermato la loro resistenza. Il danno in ippocampo sembra essere prevalentemente causato dal rilascio di glutammato e dall’infiammazione, come confermato dai trattamenti neuroprotettivi con MgCl2 e indometacina. Una reversione del danno a livelli similari al controllo è stata tuttavia raggiunta solo esponendo le colture ad un cocktail dei tre principi farmacologici. Al contrario, la curcumina è stata il farmaco più efficace nell’inibire il danno nei collicoli inferiori. La corteccia invece non ha mostrato un meccanismo preferenziale nel danno da bilirubina, con una reversione significativa quando trattata con ciascuno dei tre farmaci. I dati ricavati da questo lavoro hanno dimostrato una differente sensibilità regionale e nello sviluppo del cervello alla bilirubina, ed ha inoltre dimostrato la multifattorialità dei meccanismi di danno. Il lavoro ha inoltre permesso di identificare farmaci efficaci nel prevenire il danno al SNC, suggerendo la possibilità di un nuovo approccio terapeutico basato sulla protezione diretta del cervello.