CHARACTERIZATION OF THE ANTIMICROBIAL EFFECT OF BLUE LASER ON PSEUDOMONAS AERUGINOSA IN VITRO AND IN VIVO

The development of novel antimicrobial strategies has returned of crucial importance due to increasing resistance to conventional antibiotics. The antimicrobial effect of blue light has been recently described in several research works, but it needs further validation to be safely used in clinical practice and to find appropriate fields of application. The aims of this study were to evaluate the antimicrobial properties of blue laser light on Pseudomonas aeruginosa (PAO), to explore the mechanisms underlying the antimicrobial acttivity, to evaluate possible toxicity on human keratinocytes, to validate this effect in vivo and to evaluate the use of blue laser in antimicrobial photodynamic therapy (PDT) using free curcumin and curcumin embedded in three types of amphiphilic nanomicelles. The results of our study demonstrated how blue laser irradiation alone is able to exert antimicrobial effects towards PAO grown in different conditions (PAO grown in planktonic state and on solid surfaces) and we identified several effective irradiation parameters. Furthermore, we described also an antibiofilm activity both in disrupting a mature biofilm and in inhibiting biofilm formation. Although further and more molecular-based investigation is warranted, our results suggest, according with literature, a possible role of oxidative stress stimulation for the explanation of bacterial inhibition/death. Comparing blue laser source with LED, laser was significantly more effective. When investigating the possible toxic effects on keratinocytes, we observed slightly different effects on two keratinocyte cell lines in terms of cell viability and metabolic activity after irradiation, and identified several protocols which proved both antimicrobial efficacy and safety towards human cells. Furthermore, we highlighted a stimulation of inflammosome molecules expression as expected, but also an overexpression of highly active antimicrobial peptides (defensins), which persists hours after irradiation (especially defensin b3 and b4). When applying the protocol with wavelength 445nm, power 0,3W, irradiance 0,105W/cm2 and fluence 60J/cm2 in vivo on a mouse model of infected abrasion, we obtained a significant reduction in bacterial load in laser treated mice, but not the complete eradication as we were expecting basing on our previous results. 7 But on the other hand, when observing histological samples to evaluate possible thermal damage, we noticed a huge difference among samples: while non treated displayed a high inflammation rate permeating epidermal and dermal layers, the laser treated ones had minimum epidermal damage and were almost free of inflammatory infiltrate. Finally, we explored the possible potentiating effect of blue laser sublethal irradiation on three types of amphiphilic nanomicelles loaded with curcumin. We obtained the lowest MIC of curcumin nanoparticles described so far, which further decreased after sublethal blue laser irradiation.

Lo sviluppo di nuove strategie antimicrobiche è un argomento che è tornato di vivo interesse nella comunità scientifica, a causa dell’aumento costante della resistenza agli agenti antimicrobici convenzionali. L’effetto antimicrobico della luce blu è stato descritto in diversi recenti lavori scientifici, tuttavia necessita di ulteriori validazioni prima di poter essere applicato nella pratica clinica e per trovare degli ambiti di utilizzo appropriati. Gli obiettivi di questo studio sono stati la valutazione dell’effetto antimicrobico del laser blu su Pseudomonas aeruginosa (PAO), la caratterizzazione dei meccanismi antimicrobici coinvolti, la valutazione di possibili tossicità su cellule epiteliali umane, la validazione di tale effetto in vivo in un modello murino di abrasione infetta e il possibile utilizzo della luca laser blu in terapia fotodinamica utilizzando come fotosensitizzante la curcumina libera, e la curcumina incapsulata in tre tipi di nanomicelle anfifiliche. I risultati del nostro studio hanno dimostrato come la sola irradiazione di PAO con luce laser blu è stata sufficiente ad esercitare un effetto antimicrobico in diverse condizioni (PAO cresciuto in sospensione planktonica o su piastra), e abbiamo identificato diversi protocolli efficaci. In aggiunta, abbiamo caratterizzato anche un effetto sia su biofilm maturo cresciuto con diverse modalità, che sull’inibizione dello sviluppo del biofilm stesso. Sebbene ulteriori caratterizzazioni a livello molecolare saranno necessarie, i nostri risultati confermano un ruolo dello stress ossidativo nel meccanismo di azione antimicrobica. Comparando l’effetto della luce blu laser e LED, abbiamo rilevato un’efficacia significativamente maggiore della luce laser. Valutando lapossibile tossicità su cheratinociti umani, abbiamo rilevato effetti leggermente diversi nelle due linee cellulari utilizzate in termini di vitalità e metabolismo cellulare. Abbiamo inoltre identificato diversi protocolli che possiedono sia efficacia antimicrobica che scarsa tossicità nei confronti dei cheratinociti umani. Inoltre, abbiamo evidenziato una stimolazione dell’espressione di molecole relative all’inflammosoma come ci aspettavamo, ma anche un aumento nell’espressione genica di peptidi antimicrobici (defensine), che persiste fino a 6 ore dall’esposizione alla luce laser blu (soprattutto per quanto riguarda le defensine b3 e b4). Applicando così il protocollo con lunghezza d’onda 445nm, potenza 0,3W, irradianza 0,105W/cm2 e fluenza 60J/cm2 in un modello murino di abrasione infetta, abbiamo ottenuto una riduzione significativa della carica batterica, ma non un’eradicazione completa come ci saremmo aspettati considerando i risultati precedenti. D’altra parte, osservando i campioni dal punto di vista istologico per valutare possibili danni termici, abbiamo rilevato una grande differenza tra i due gruppi: mentre i campioni non trattati presentavano un grande livello di infiammazione attraverso tutto lo strato dermico ed epidermico, i campioni trattati con il laser presentavano un danno termico minimo insieme ad un modesto infiltrato infiammatorio omogeneo. Infine, abbiamo valutato l’utilizzo di un protocollo subletale di laser blu in terapia fotodinamica su tre tipi di nanomicelle anfifiliche con curcumina, ottenendo la concentrazione minima inibente antimicrobica più bassa di nanoparticelle di curcumina descritta finora, che si è abbassata ulteriormente con l’aggiunta della luce laser blu.