In diagnostics, many tools rely on the detection of specific markers in biological specimens and widely exploit the ability of antibodies to recognize their antigen. Thus, the implementation of the various processes ranging from antibody isolation to their high rate production is fundamental. Thanks to the advantages of recombinant DNA technologies, in vitro display methods have been developed for large scale isolation of monoclonal antibodies. Phage display is a technology based on the screening of an antibody library against a given antigen. The antibody library is usually composed of randomly combined immunoglobulin’s light and heavy variable domains fused with a coat protein of the bacteriophage M13. Each phage exposes on its surface a single peptide, so the coding sequence of the antibody fragments can be easily retrieved. The main objective of this work is to optimize a pipeline for recombinant monoclonal antibody development against antigens of diagnostic interest. This process begins with the isolation from a naïve phage library of clones able to recognize the antigen. Therefore, this work started with the creation and the characterization of a naïve phage display library. Once constructed the library, it has been validated with NGS to have an actual snapshot about library diversity and with Sanger sequencing to assess the quality of the coding sequences. To optimize and validate the whole pipeline, as a “pilot” antigen it has been chosen Interferon γ, a diagnostically relevant protein given its employment in the detection of tuberculosis. Different biopanning procedures allowed to isolate, overall, 25 different scFv. Thanks to a deeper characterization, performed on an automated platform designed for immunodiagnostic testing, it was possible to point out the best performing clones. Among them, two were chosen to be maturated to further enhance their affinity towards the antigen. Since it is well established the key role played by the VH in antigen recognition, it has been decided to create two new phage display libraries composed of scFv all bearing the VH of the two parental clones and a panel of VLs. The tailored selection procedure allowed to isolate two clones that seemed to perform better than the parental one on the automated platform. In a diagnostic setting, usually, full-size immunoglobulins are required, so, once selected, the antibody fragments are cloned in vectors allowing the expression in mammalian host cell lines. In this work a set of vectors allowing the expression of the human IgG, IgA, IgM and mouse IgG has been built. All the vectors have been transfected and antibody production was good also in terms of correct folding of the full-size immunoglobulin. The final step of validation of this whole pipeline consists in the expression of all the three anti-Interferon γ scFv as full-size immunoglobulin and the assay of their functionality on an automated platform as reagents in a commercial tuberculosis diagnostic kit.

Molte tecnologie sviluppate in campo diagnostico si basano sull’individuazione di specifici marcatori presenti nei campioni biologici. In questo ambito è ampiamente sfruttata la capacità intrinseca degli anticorpi di riconoscere il loro antigene. Pertanto, è fondamentale implementare i vari processi che permettono il rapido isolamento degli anticorpi e che ne garantiscono un alto livello di produzione. Grazie al continuo avanzamento delle tecnologie del DNA ricombinante, sono state sviluppate tecnologie in vitro che permettono l'isolamento su larga scala di anticorpi monoclonali. Il phage display è una tecnologia basata sullo screening di una libreria di anticorpi contro un dato antigene. La libreria di anticorpi è di solito composta da domini variabili delle catene leggere e pesanti di una immunoglobulina combinati casualmente, questi domini sono fusi con una proteina del capside del batteriofago M13. Ogni fago espone sulla sua superficie un singolo peptide, quindi si può facilmente risalire alla sequenza codificante dei frammenti anticorpali. L'obiettivo principale di questo lavoro è quello di ottimizzare l’intera pipeline che consente lo sviluppo di anticorpi monoclonali ricombinanti interessanti in ambito diagnostico. Questo processo inizia con l'isolamento di cloni in grado di riconoscere l'antigene partendo da una libreria fagica naïve. Pertanto, questo lavoro è iniziato con la creazione e la caratterizzazione di una libreria fagica naïve. Una volta costruita la libreria, questa è stata validata mediante NGS, in questo modo è stato possibile avere un'istantanea della sua diversità. La libreria è stata ulteriormente validata mediante il classico sequenziamento di Sanger in modo da poter anche valutare la qualità delle sequenze codificanti dei frammenti anticorpali che la compongono. Per ottimizzare e validare l'intera pipeline, come antigene “pilota” è stato scelto Interferone γ, una proteina rilevante da un punto di vista diagnostico perché è utilizzata nella diagnosi della tubercolosi. Diverse procedure di biopanning hanno permesso di isolare, complessivamente, 25 scFv diversi. Questi cloni sono stati testati anche su una piattaforma automatizzata progettata per i test immunodiagnostici e questo ne ha permesso una caratterizzazione più approfondita. In questo modo è stato possibile isolare i cloni che mostravano le prestazioni migliori. Tra questi, sono stati scelti due cloni per essere ulteriormente maturati in modo da migliorare la loro affinità nei confronti dell'antigene. Considerato che il ruolo chiave svolto dalla VH nel riconoscimento dell'antigene è ben noto, è stato deciso di creare due nuove librerie di display fagico composte da scFv tutti recanti la VH dei due cloni parentali e un pannello di VL. La procedura di selezione ha permesso di isolare due cloni che sembrano funzionare meglio rispetto il clone parentale quando testati sulla piattaforma automatizzata. In campo diagnostico, generalmente, sono utilizzate immunoglobuline nel loro formato nativo. Quindi, una volta selezionati i frammenti anticorpali, questi devono essere clonati in vettori che ne consentano l'espressione in linee cellulari di mammifero. In questo lavoro è stata costruita una serie di vettori che consentono l'espressione delle IgG, IgA, IgM umane e IgG di topo. Tutti i vettori sono stati trasfettati e la produzione di anticorpi è stata buona anche in termini di corretto folding dell'immunoglobulina. La fase finale di convalida dell'intera pipeline consiste nell'espressione dei tre cloni gli anti-interferone γ come immunoglobuline in formato nativo e nel test della loro funzionalità sulla piattaforma automatizzata come reagenti in un kit diagnostico della tubercolosi commerciale.

Optimization of a pipeline for the development of recombinant monoclonal antibodies for diagnostics

MARANO, FRANCESCA
2020-03-18

Abstract

Molte tecnologie sviluppate in campo diagnostico si basano sull’individuazione di specifici marcatori presenti nei campioni biologici. In questo ambito è ampiamente sfruttata la capacità intrinseca degli anticorpi di riconoscere il loro antigene. Pertanto, è fondamentale implementare i vari processi che permettono il rapido isolamento degli anticorpi e che ne garantiscono un alto livello di produzione. Grazie al continuo avanzamento delle tecnologie del DNA ricombinante, sono state sviluppate tecnologie in vitro che permettono l'isolamento su larga scala di anticorpi monoclonali. Il phage display è una tecnologia basata sullo screening di una libreria di anticorpi contro un dato antigene. La libreria di anticorpi è di solito composta da domini variabili delle catene leggere e pesanti di una immunoglobulina combinati casualmente, questi domini sono fusi con una proteina del capside del batteriofago M13. Ogni fago espone sulla sua superficie un singolo peptide, quindi si può facilmente risalire alla sequenza codificante dei frammenti anticorpali. L'obiettivo principale di questo lavoro è quello di ottimizzare l’intera pipeline che consente lo sviluppo di anticorpi monoclonali ricombinanti interessanti in ambito diagnostico. Questo processo inizia con l'isolamento di cloni in grado di riconoscere l'antigene partendo da una libreria fagica naïve. Pertanto, questo lavoro è iniziato con la creazione e la caratterizzazione di una libreria fagica naïve. Una volta costruita la libreria, questa è stata validata mediante NGS, in questo modo è stato possibile avere un'istantanea della sua diversità. La libreria è stata ulteriormente validata mediante il classico sequenziamento di Sanger in modo da poter anche valutare la qualità delle sequenze codificanti dei frammenti anticorpali che la compongono. Per ottimizzare e validare l'intera pipeline, come antigene “pilota” è stato scelto Interferone γ, una proteina rilevante da un punto di vista diagnostico perché è utilizzata nella diagnosi della tubercolosi. Diverse procedure di biopanning hanno permesso di isolare, complessivamente, 25 scFv diversi. Questi cloni sono stati testati anche su una piattaforma automatizzata progettata per i test immunodiagnostici e questo ne ha permesso una caratterizzazione più approfondita. In questo modo è stato possibile isolare i cloni che mostravano le prestazioni migliori. Tra questi, sono stati scelti due cloni per essere ulteriormente maturati in modo da migliorare la loro affinità nei confronti dell'antigene. Considerato che il ruolo chiave svolto dalla VH nel riconoscimento dell'antigene è ben noto, è stato deciso di creare due nuove librerie di display fagico composte da scFv tutti recanti la VH dei due cloni parentali e un pannello di VL. La procedura di selezione ha permesso di isolare due cloni che sembrano funzionare meglio rispetto il clone parentale quando testati sulla piattaforma automatizzata. In campo diagnostico, generalmente, sono utilizzate immunoglobuline nel loro formato nativo. Quindi, una volta selezionati i frammenti anticorpali, questi devono essere clonati in vettori che ne consentano l'espressione in linee cellulari di mammifero. In questo lavoro è stata costruita una serie di vettori che consentono l'espressione delle IgG, IgA, IgM umane e IgG di topo. Tutti i vettori sono stati trasfettati e la produzione di anticorpi è stata buona anche in termini di corretto folding dell'immunoglobulina. La fase finale di convalida dell'intera pipeline consiste nell'espressione dei tre cloni gli anti-interferone γ come immunoglobuline in formato nativo e nel test della loro funzionalità sulla piattaforma automatizzata come reagenti in un kit diagnostico della tubercolosi commerciale.
SBLATTERO, DANIELE
32
2018/2019
Settore BIO/13 - Biologia Applicata
Università degli Studi di Trieste
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Descrizione: tesi di dottorato
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11368/2961110
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