Ricerca proteomica nei tumori uterini maligni e benigni

Uterine myometrium and endometrium are tissues with more variations in post trascriptional pre m-RNA maturation. The variations are directly related to the fisiologic female hormonal cycle which contributes to generating genomic complexity and uterine proteomics. These variations can play an important role in the development of myometrial and endometrial tumor. We collected tissues samples from 13 patients who undergo hysterectomy for symptomatic myomas. For phosphoproteins identification on 7 patients we combined the use of two-dimensional gel electrophoresis, with immobilized metal affinity chromatography and Pro-Q Diamond phosphoprotein gel stain. We used mass spectrometry for proteins and phosphoproteins identification and Western blotting for 2-DE data validation. By using a combination of IMAC enrichment, 2-DE, Diamond Pro-Q staining, and mass spectrometry, we identified 32 phosphoproteins differentially expressed in the leiomyoma as compared to the myometrium. We verify by Immunoblot the alteration of HSPB1, HSPA5 and VINC. The top Networks in which these proteins are involved are apoptosis and cell proliferation. We could confirm a significant difference of these phosphoproteins in tumor vs normal tissue. Then we compared proteins expression of Leiomyomas on 3 patients treated for at least 3 months with Ulipristal Acetate (UPA) versus Leiomyomas on 3 patients never treated. The analysis was conducted using 2-DE with mass spectrometry. We found 9 proteins differentially expressed in the leiomyoma as compared to the Leiomyoma treated with UPA. PDIA3, CRABP2, DES, MYL9 were protein with a lower concentration in Leiomyoma treated with UPA. Our study highlights the involvement of the phosphoproteome in leiomyoma growth. We identified phosphoproteins involved in the inhibition of apoptosis and cell proliferation and these data show the existence of a relation between phosphorylation and leiomyoma development. Our work give a possible interpretation of the effect of UPA on leiomyoma. Probably it has a direct effect on abnormal citoskeletal proteins reducing tumor growth. For Endometrial cancer (EC) A total of 16 patients (10 women suffering from EC and 6 non-EC controls) were recruited. Two-dimensional gel electrophoresis (2 DE) was performed. We use Mass Spectometry for proteins identification. Then we validate our data with Western blotting The analysis revealed 25 protein spots with different abundance in the uterine aspirate of the EC. Of these, ABRACL, PGAM2, FGB, ANXA3 were present only in EC. Only ABRACL and PGAM2 are able to discriminate the controls, from the EC patients. In this study we demonstrate that uterine aspirates are a valuable biological fluid for the identification of cancer biomarkers. Proteins like ABRACL and PGAM2 have a great potential to reach the clinical phase after a validation phase

Miometrio ed endometrio uterini sono tra i tessuti che presentano le variazioni più marcate della maturazione post-trascrizionale del pre-mRNA. Questo fenomeno contribuisce in maniera determinante a generare la complessità genomica e proteomica tessuto-specifica. Queste variazioni giocano un ruolo importante nello sviluppo di tumori miometriali ed endometriali. Abbiamo raccolto campioni di 13 pazienti sottoposte ad isterectomia per miomi sintomatici. Per l’identificazione delle fosfoproteine in solo 7 pazienti abbiamo combinato l’utilizzo dell’elettroforesi su gel bidimensionale, con tecnica IMAC (immobilized metal affinity chromatography) e colorante per fosfoproteine Pro Q Diamond. Abbiamo usato la Spettrometria di massa per l’identificazione di proteine e fosfoproteine ed il Western blotting per la validazione dei dati derivati dall’elettroforesi su gel bidimensionale. Usando una combinazione di elettroforesi su gel bidimensionale, di IMAC, di colorante Pro Q Diamond e di spettrometria di massa abbiamo identificato 32 fosfoproteine espresse in modo diverso nel tessuto miometriale sano rispetto a quello del fibroma. Abbiamo verificato, inoltre, attraverso l’Immunoblot l’alterazione di HSPB1, HSPA 5 e di VINC. I principali processi in cui queste proteine sono coinvolte sono quello di apoptosi e quello di proliferazione cellulare. Possiamo confermare, dunque, una espressione diversa di queste fosfoproteine nel leiomioma rispetto al tessuto normale. Successivamente abbiamo confrontato l’espressione proteica dei leiomiomi in 3 pazienti affette da miomatosi uterina e sottoposte ad isterectomia rispetto ad altre 3 pazienti affette da miomatosi uterina e sottoposte ad isterectomia ma che avevano eseguito terapia con Ulipristal acetato (UPA) per almeno 3 mesi. L’analisi è stata condotta utilizzando l’elettroforesi su gel bidimensionale e la spettrometria di massa. Abbiamo individuato 9 proteine espresse in modo diverso nel leiomioma rispetto al leiomioma trattato con UPA. PDIA3, CRABP2, DES, MYL9 sono risultate essere meno espresse nei leiomiomi trattati con UPA. Il nostro studio mette in luce, dunque, il coinvolgimento del fosfoproteoma nella crescita dei miomi. Abbiamo individuato, infatti, fosfoproteine coinvolte nei processi di inibizione dell’apoptosi e di proliferazione cellulare e questi dati dimostrano il coinvolgimento della fosforilazione nella crescita dei miomi. Il nostro lavoro, inoltre, da una possibile interpretazione dell’effetto di UPA sui leiomiomi. Probabilmente l’UPA ha un effetto diretto sulle proteine anormali del citoscheletro riducendo la crescita del fibroma. Per quanto riguarda il carcinoma endometriale sono state reclutate un totale di 16 pazienti (10 affette da carcinoma endometriale e 6 facenti parte del gruppo di controllo). Abbiamo eseguito l’elettroforesi su gel bidimensionale. Abbiamo poi utilizzato la spettrometria di massa per l’identificazione delle proteine. Infine abbiamo validato i nostri dati mediante Western blotting. L’analisi ha rilevato 25 spot proteici con differente concentrazione nell’aspirato uterino delle donne affette da carcinoma. Di queste ABRACL, PGAM2, FGB, ANXA3 erano presenti esclusivamente nelle donne con carcinoma endometriale. Solo 2 però, ABRACL and PGAM2 furono in grado di discriminare le pazienti affette dai controlli. In questo studio abbiamo dimostrato che l’aspirato uterino è un fluido biologico valido per l’identificazione di biomarker tumorali. Proteine come ABRACL e PGAM2 hanno un grande potenziale di arrivare ad una fase clinica dopo aver superato una fase di validazione