Structural studies of enzymes: a bacterial flippase and a human kinase

Questa tesi di dottorato include il lavoro di ricerca su due progetti diversi riguardanti l’espressione, la purificazione e la caratterizzazione di due enzimi. Il primo progetto è stato svolto all’Università di Trieste sotto la supervisione della professoressa Rita De Zorzi ed era volto alla caratterizzazione strutturale della O antigen flippasi Wzx da Pseudomonas aeruginosa. Wzx è una proteina integrale di membrana che si trova nella membrana interna dei batteri gram-negativi ed è coinvolta nella biosintesi del lipopolisaccaride (LPS). P. aeruginosa è un patogeno opportunista e uno delle principali cause delle infezioni nosocomiali, è inoltre particolarmente difficile da eradicare a causa della resistenza del batterio agli antibiotici. Essendo Wzx un enzima fondamentale per la formazione della parete cellulare, questa proteina potrebbe essere un promettente bersaglio per una nuova classe di antibiotici e di adiuvanti degli antibiotici. Le procedure di espressione e purificazione di Wzx sono state ottimizzate portando a una considerevole resa della proteina di membrana utilizzabile per gli studi cristallografici. Sono stati ottenuti dei piccoli cristalli in condizioni differenti che, considerando la differenza dei parametri di cella unitaria, sono stati ottimizzati. Finora la qualità dei cristalli non ha permesso la determinazione della struttura. Parallelamente, il folding e la stabilità della proteina sono stati investigati con il dicroismo circolare e la spettroscopia a fluorescenza. Inoltre, le spettroscopie IR e Raman hanno fornito informazioni sul processo di degradazione di Wzx. Lo stato oligomerico della proteina è stato investigato con il microscopio elettronico utilizzando la tecnica del negative staining. Il secondo progetto è stato svolto nel Laboratorio di Biologia Strutturale di Elettra Sincrotrone (Trieste) sotto la supervisione della dottoressa Paola Storici. Questo progetto era volto alla determinazione strutturale del complesso tra la Glicogeno Sintasi Chinasi 3 (GSK3-) e il suo inibitore SR90, sintetizzato nel laboratorio della dottoressa Stephanie Federico all’Università di Trieste. GSK3- catalizza l’addizione di un gruppo fosfato a specifiche proteine bersaglio e fa parte dei meccanismi di regolazione di molteplici vie metaboliche tra cui le cascate di segnale associate ai disordini neurodegenerativi. Visto che un’inibizione di questa chinasi può essere benefica per il trattamento di queste patologie, l’inibitore SR90 è stato progettato per legarsi covalentemente con GSK3-. Inoltre, SR90 è in grado di inibire un’altra chinasi, la casein chinasi1  (CK1-), competendo con il legame dell’ATP. Anche CK1- è coinvolta nelle patologie neurodegenerative e fosforila I substrati di GSK3- agendo come chinasi iniziatrice. Tre costrutti sono stati clonati ed espressi in cellule d’insetto: la proteina intera e due costrutti troncati, corrispondenti ai residui 25-393 e 35-386 rispettivamente in cui sono stati rimossi i terminali a causa della loro flessibilità che può pregiudicare la cristallizzazione. L’attività dell’inibitore sulla chinasi è stata investigata con il Thermal Shift Assay per determinare l’effetto del legame sulla stabilità della proteina. Visto che il composto si è dimostrato in grado di stabilizzare la conformazione proteica, sono state effettuate delle prove di cristallizzazione su GSK3- 35-386 complessato con SR90. I dati di diffrazione dei raggi X sui cristalli proteici sono stati raccolti al Sincrotrone ottenendo dati a una risoluzione 2.3 Å. L’analisi della mappa di densità elettronica ha dimostrato la formazione di un legame covalente tra la proteina e l’inibitore.