Identificazione e caratterizzazione funzionale di nuovi geni candidati e varianti associate a Sordità Ereditaria e Presbiacusia

Hearing loss is the most common sensory disorder affecting over half a million of people. In this study we will consider two forms of deafness, Non-Syndromic Hereditary Hearing Loss and Age-Related Hearing Loss. Non-Syndromic Hereditary Hearing Loss (NSHHL) is a sensorineural disorder with high genetic heterogeneity and over 115 genes already associated. Through whole exome sequencing and data aggregation we identified an Italian family with six affected individuals and two unrelated Dutch patients displaying NSHHL and carrying predicted-to-be deleterious missense variants in USP48. We uncovered a ninth French patient presenting unilateral cochlear nerve aplasia and presenting a de-novo splice variant in the same gene. USP48 encodes for a de-ubiquitinating enzyme under evolutionary constraint. Pathogenicity of the missense variants is supported by 3D protein modeling and in-vitro functional assays. Immunohistology experiments showed that USP48 is expressed in specific structures of the developing human inner ear. Engineered zebrafish knocked-down models for the USP48 orthologue presented with a delayed in development of primary motoneurons, less developed and less organized statoacoustic neurons innervating the ears, decreased swimming velocity and circling swimming behavior indicative of vestibular dysfunction and hearing impairment. Acoustic startle response assays revealed a significant decrease of auditory response of usp48 knocked-down zebrafish at 600Hz and 800Hz wavelengths. In conclusion, we describe a novel autosomal dominant NSHHL gene through a multipronged approach combining exome sequencing, animal modeling, immunohistology and molecular assays. Age-related hearing loss (ARHL) or prebycusis is the most common sensory disorder in aging individuals. In spite of an incidence of more than 30% in individuals over 65 years, only few susceptibility genes have been identified so far. The analysis of a set of 46 ARHL candidate genes in a cohort of 464 Italian ARHL patients allowed the identification of a series of ultra-rare likely pathogenic variants in DCLK1, SLC28A3, CEP104, and PCDH20 genes. The potentially causative role of these variants has been tested through functional in-silico and in-vitro studies. While, the expression of these genes in the structures responsible for the auditory function has been evaluated through the study of the Mouse or Zebrafish orthologs. These results provide novel insights in the genetic and molecular bases of this complex and heterogeneous common disorder.

La perdita dell'udito è la più comune patologia sensoriale che colpisce oltre mezzo milione di persone. In questo studio abbiamo analizzato due forme di sordità (monogenica e multifattoriale): l’ipoacusia ereditaria non sindromica e la presbiacusia. La sordità ereditaria non sindromica è una patologia neurosensoriale con elevata eterogeneità genetica e oltre 115 geni già associati. Attraverso il sequenziamento dell'intero esoma abbiamo studiato quattro famiglie affette da sordità ereditaria non sindromica (sei pazienti italiani, due pazienti olandesi ed una paziente francese), nelle quali abbiamo identificato delle varianti missenso predette patogenetiche a carico del gene USP48. USP48 codifica per un enzima con funzione di de-ubiquitinasi ed è conservato in diverse specie animali. Abbiamo dimostrato la patogenicità delle varianti missenso identificate mediante modelli 3D delle proteine e saggi funzionali in-vitro. Gli esperimenti di immunoistologia hanno dimostrato che USP48 è espresso in specifiche strutture dell'orecchio interno umano in via di sviluppo. Successivamente, abbiamo ingegnerizzato dei modelli knock-down di zebrafish per il gene ortologo usp48 i quali hanno manifestato un ritardo nello sviluppo dei moto-neuroni primari, ridotto sviluppo e disorganizzazione dei neuroni statoacustici, essenziali per la funzione uditiva, una riduzione della velocità di locomozione ed una capacità natatoria alterata, nello specifico di nuoto in circolo, indicativo di disfunzione vestibolare e deficit uditivo.I test per l’analisi della capacità uditiva hanno rivelato una riduzione significativa della risposta uditiva degli zebrafish ingegnerizzati, alle lunghezze d'onda di 600 Hz e 800 Hz. In conclusione, abbiamo identificato un nuovo gene, USP48 associato a sordità ereditaria autosomica dominante non sindromica mediante un approccio multi-step che associa il sequenziamento dell'esoma, l’ingegnerizzazione di un modello animale, l’immunoistologia di tessuti umani e saggi molecolari. Per quanto riguarda la presbiacusia, questa è considerata il disturbo sensoriale più comune nella popolazione anziana. Nonostante un'incidenza di oltre il 30% negli individui di età superiore ai 65 anni, finora sono stati identificati solo pochi geni potenzialmente correlati allo sviluppo di tale malattia. In questo studio, è stato analizzato un set di 46 geni candidati in una coorte di 464 pazienti italiani affetti da presbiacusia. L’analisi ha consentito l'identificazione di una serie di varianti potenzialmente patogenetiche ultra-rare nei geni DCLK1, SLC28A3, CEP104 e PCDH20. L’effetto di queste varianti è stato valutato attraverso studi funzionali in-silico e in-vitro, mentre l'espressione dei geni nelle strutture deputate alla funzione uditiva è stata valutata attraverso l’analisi dei geni ortologhi in topi e zebrafish. Questi risultati forniscono nuove importanti informazioni sulle basi genetiche e molecolari della perdita dell’udito che è un disturbo molto comune, complesso ed eterogeneo.