Studio UV Raman Risonante sulla struttura proteica, sulla fibrillazione e sull'interazione proteina-ligando

The term “proteinopathy” was coined to indicate a class of disorders related to protein misfolding such as Alzheimer’s (AD) and Parkinson’s (PD) diseases. Nowadays, dementias, AD and type II diabetes are considered within the top 20 causes of death worldwide by World Health Organization (WHO). Misfolding not only induces the loss of proteins’ biological functions, but also promotes a thermodynamically favoured process called “aggregation”, that generally ends with the formation of protein fibrils, i.e. an ordered thread-like structure made of misfolded proteins. The formation of non-native protein species as well as the formation of fibrils deposits within or outside cells could compromise the native biological functions of cells, tissues and organs. Despite UV Resonance Raman (UVRR) spectroscopy does not offer high-structural resolution measurements, it provides valuable insights on the native-like structure of the sample, thus overcoming the limitations of cryo-EM and ssNMR. To name few advantages, UVRR spectroscopy offers the possibility to work in diluted, native-like aqueous conditions, without requiring a chemical manipulation of the sample. More importantly, UVRR spectroscopy opens the possibility to selectively enhance the Raman cross section of peculiar protein chromophore vibrational modes depending on the radiation excitation energy chosen. The aim of the this Ph.D. thesis is to show the usefulness of UV Resonance Raman (UVRR) spectroscopy for the structural investigation of protein fibrils and also of protein-ligand interactions, linking the behaviour of several spectroscopic biomarkers to the structural modification of proteins during both phenomena. In particular: - we demonstrated the ability of UVRR spectroscopy to get important insights on the structural modification of proteins upon fibrillation and upon interaction with ligands, by studying the fibrillation of hen egg white lysozyme (HEWL) and human insulin and their interaction with an antioxidant, which is resveratrol. We provide a solid spectroscopic approach based on UVRR spectroscopy and complemented by other classical spectroscopic techniques, with the aim to translate this multi-technique approach towards the investigation of a more interesting class of proteins, i.e. the intrinsically disordered proteins. - we characterized a novel mechanism of fibrillation of E.Coli dihydrofolate reductase (DHFR), induced at neutral pH by the presence of spermine. In fact, the interaction with spermine induces a partial inhibition of the enzymatic activity, stabilizing DHFR in a high energy conformer. This structure remains stable for few days, then starts to precipitate into insoluble fibrils. The mechanism of interaction between E.Coli DHFR and spermine has been discussed in this section, providing a clear example of a fibrillation-inducing ligand. -in the last section, the solid UVRR-based protocol tested with model systems, and the identification of peculiar UVRR spectral biomarkers sensitive to protein fibrillation and to interaction with ligands have been exploited dealing with a well-known intrinsically disordered protein (IDP), which is α-synuclein (aS). We proposed an alternative method of UVRR spectra analysis based on the use of an external protein reference to elucidate the structure of aS and its C-terminus truncated form, (1-120) aS. We proposed an alternative method of UVRR spectra analysis based on the use of an external protein reference roughly estimate how many Tyr residues are solvent-protected in the case of both aS fibrils and monomers, obtaining results in line with the recent literature.

Il termine "proteinopatia" è stato coniato per indicare una classe di disturbi legati al mal ripiegamento delle proteine come le malattie di Alzheimer (AD) e Parkinson (PD). Oggi, le demenze, l'AD e il diabete di tipo II sono considerati tra le prime 20 cause di morte in tutto il mondo dall'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS). Il mal-ripiegamento non solo induce la perdita delle funzioni biologiche delle proteine, ma promuove anche un processo termodinamicamente favorito chiamato "aggregazione", che generalmente termina con la formazione di fibrille proteiche, cioè una struttura filiforme ordinata fatta di proteine mal ripiegate. La formazione di specie proteiche non native e la formazione di depositi di fibrille all'interno o all'esterno delle cellule potrebbero compromettere le funzioni biologiche native di cellule, tessuti e organi. Nonostante la spettroscopia UV Raman Risonante (UVRR) non fornisca misure ad alta risoluzione, questa offre preziose informazioni sulla struttura nativa del campione, superando così le limitazioni di cryo-EM e ssNMR. Per citare alcuni vantaggi, la spettroscopia UVRR offre la possibilità di lavorare in condizioni acquose, diluite, senza richiedere manipolazioni chimiche del campione. Ancora più importante, la spettroscopia UVRR offre la possibilità di aumentare selettivamente la sezione d'urto Raman dei modi vibrazionali di peculiari cromofori proteici a seconda dell'energia di eccitazione scelta. Lo scopo di questa tesi di dottorato è quello di mostrare l'utilità della spettroscopia UVRR per l'indagine strutturale delle fibrille proteiche e anche delle interazioni proteina-ligando, collegando il comportamento di diversi biomarkers spettroscopici alla modifica strutturale delle proteine durante entrambi i fenomeni. In particolare: - abbiamo dimostrato la capacità della spettroscopia UVRR di ottenere importanti informazioni sulla modifica strutturale delle proteine durante la fibrillazione e durante l'interazione con i ligandi, studiando la fibrillazione del lisozima contenuto nell'albume d'uovo di gallina (HEWL) e dell'insulina umana e la loro interazione con un antiossidante, il resveratrolo. Abbiamo fornito un solido approccio spettroscopico basato sulla spettroscopia UVRR e completato da altre classiche tecniche spettroscopiche, con l'obiettivo di tradurre questo approccio multi-tecnica verso l'indagine di una classe più interessante di proteine, cioè le proteine intrinsecamente disordinate. - abbiamo caratterizzato un nuovo meccanismo di fibrillazione della diidrofolato reduttasi (DHFR) di E.Coli, indotta a pH neutro dalla presenza di spermina. Infatti, l'interazione con la spermina induce una parziale inibizione dell'attività enzimatica, stabilizzando il DHFR in un conformatore ad alta energia. Questa struttura rimane stabile per alcuni giorni, poi inizia a precipitare in fibrille insolubili. Il meccanismo di interazione tra E.Coli DHFR e la spermina è stato discusso in questa sezione, fornendo un chiaro esempio di ligando che induce la fibrillazione. -Nell'ultima sezione, il solido protocollo basato su UVRR testato con sistemi modello, e l'identificazione di peculiari biomarcatori spettrali UVRR sensibili alla fibrillazione della proteina e all'interazione con ligandi sono stati sfruttati trattando una nota proteina intrinsecamente disordinata (IDP), che è l'α-sinucleina (aS). Abbiamo proposto un metodo alternativo di analisi degli spettri UVRR basato sull'uso di un riferimento proteico esterno per chiarire la struttura di aS e la sua forma troncata al C-terminale, (1-120) aS. Abbiamo proposto un metodo alternativo di analisi degli spettri UVRR basato sull'uso di un riferimento proteico esterno per stimare approssimativamente quanti residui Tyr sono protetti dal solvente nel caso sia delle fibrille che dei monomeri di aS, ottenendo risultati in linea con la recente letteratura.