Ruolo di TRIM18, gene che causa la sindrome di Opitz, nel controllo della ciliogenesi attraverso l'autofagia

TRIM18/MID1 is an E3 Ubiquitin ligase belonging to the TRIM family of proteins that localises on microtubules. Loss-of-function mutations in the MID1 gene have been associated with the X-linked form of Opitz G/BBB syndrome, a genetic disorder characterised by defects in ventral midline development. Within the cell, MID1 exists as a microtubular macromolecular complex, consisting of several MID1 interactors not all identified yet. Among them, α4 is one of the regulatory subunits of Protein Phosphatase 2A (PP2A). MID1 has been reported to decrease the microtubular pool of PP2A catalytic subunit (PP2Ac) protein levels, thus leading to hypo-phosphorylation of its target proteins. MID1-lacking cells show increased levels of PP2Ac and a reduced association between mTOR and Raptor, leading to a downregulation of the mTORC1 signalling complex. This suggest that MID1 may act upstream of the mTORC1 signalling. Nevertheless, Opitz syndrome pathogenetic mechanisms have not been understood yet, but some clinical features are shared with another class of pathologies where genes controlling primary cilium dynamics are mutated, i.e. ciliopathies. Given this, we hypothesised that MID1 might be involved in the regulation of processes in which the primary cilium is directly or indirectly involved. The role of MID1 in primary cilium was investigate in a human epithelial cell line and in wild-type and Mid1-/Y Mouse Embryo Fibroblasts (MEFs). The data show that MID1 overexpression and Mid1 depletion both cause impairment in primary ciliogenesis and/or primary cilia length, suggesting a role in the regulation of ciliary assembly. Being primary cilium dynamics regulated by autophagy, also controlled through mTORC1 signalling, we asked whether primary cilia impairments caused by MID1 could be due to misregulations in the autophagy pathway. By analysing the same cellular models, we observed alterations in basal autophagy and in the starvation-induced autophagy flux in MID1-overexpressing cells and in Mid1-/Y MEFs. My results indicate that MID1 is a negative regulator of both ciliogenesis and ciliary elongation – depending on cell type and culture condition – as well as a regulator of autophagy pathway, as reported for other members of the TRIM family. Taken together our results can give new insights on the Opitz syndrome pathogenetic mechanisms and we can suggest to consider this disease as a new ciliopathy.

TRIM18/MID1 è una E3-Ubiquitina ligasi appartenente alla famiglia di proteine TRIM che si localizza sui microtubuli. Le mutazioni con perdita di funzione nel gene MID1 sono state associate alla forma legata all'X della sindrome di Opitz, una malattia genetica caratterizzata da difetti nello sviluppo della linea mediana ventrale. All'interno della cellula, MID1 esiste come un complesso macromolecolare microtubulare, costituito da diversi interattori non tutti ancora identificati. Tra questi, α4 è una delle subunità regolatorie della proteina fosfatasi 2A (PP2A). È stato riportato che MID1 riduce il pool microtubulare dei livelli proteici della subunità catalitica di PP2A (PP2Ac), portando così all'ipofosforilazione dei suoi substrati. Le cellule prive di MID1 mostrano livelli aumentati di PP2Ac e una ridotta associazione tra mTOR e Raptor, portando a una downregulazione della via di segnalazione di mTORC1. Ciò suggerisce che MID1 può agire a monte della segnalazione di mTORC1. Tuttavia, i meccanismi patogenetici della sindrome di Opitz non sono ancora stati del tutto compresi, ma alcune caratteristiche cliniche sono condivise con un'altra classe di patologie in cui i geni che controllano le dinamiche del ciglio primario sono mutati, ovvero le ciliopatie. Detto questo, abbiamo ipotizzato che MID1 possa essere coinvolto nella regolazione dei processi in cui il ciglio primario è direttamente o indirettamente coinvolto. Il ruolo di MID1 nel ciglio primario è stato studiato in una linea di cellule epiteliali umane e in fibroblasti di embrioni di topo (MEF) wild-type e Mid1-/Y. I dati mostrano che la overespressione di MID1 e la delezione di Mid1 nelle cellule di topo causano entrambe difetti della ciliogenesi e/o della lunghezza del ciglio primario, suggerendo un ruolo nella regolazione dell'assemblaggio di questo organello. Essendo le dinamiche del ciglio primario regolate dall'autofagia, controllata a sua volta anche attraverso la segnalazione di mTORC1, ci siamo chiesti se i difetti del ciglio primario causati da MID1 potessero essere dovute ad alterazioni nella via dell'autofagia. Analizzando gli stessi modelli cellulari, abbiamo osservato alterazioni nell'autofagia basale e nel flusso autofagico indotto dalla mancanza di nutrienti nelle cellule che overesprimono MID1 e nei MEF deleti per Mid1. I miei risultati indicano che MID1 è un regolatore negativo sia della ciliogenesi che dell'allungamento del ciglio, a seconda del tipo di cellula e delle condizioni di coltura, nonché un regolatore dell'autofagia, come riportato per altri membri della famiglia TRIM. Presi insieme i nostri risultati possono far comprendere i meccanismi patogenetici della sindrome di Opitz e suggeriamo di considerare questa malattia come una nuova ciliopatia.