Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic immune-mediated condition of the gastrointestinal tract that includes Crohn disease and ulcerative colitis. Pediatric IBDs are of particular interest since their incidence is rising and, even if different pharmacological strategies are used, the optimal treatment is far from being achieved. In the first part of the thesis project the role of the lncRNA GAS5 was studied, reporting the possible involvement of this lncRNA in the pathogenesis process of tissue damage, thorough the regulation of mediators of tissue injury, in particular MMP-2 and MMP-9. From data obtained on biopsy tissues of pediatric patients affected by IBD and from in vitro experiments, it is clear that GAS5 could be involved in the processes of tissue damage and in determining a chronic inflammatory state regulating the expression of MMP-2 and MMP-9, proteases that, in IBD cause serious damage to the intestinal wall. The identification of a molecular target capable of modulating the levels of these enzymes would allow not only to deepen the knowledge about the causes of an altered production of MMP-2 and MMP-9 but also to develop a targeted pharmacological strategy. Moreover after a RNA-IP experiment it was shown that this lncRNA was able to bind and interact physically with NF-κB, a transcriptional factor involved in inflammation process, GAS5 bind NF-κB probably modulating its transcriptional activity, demonstrating the involvement of this lncRNA in inflammation and a confirming its role as biomarker of inflammation. To date, there is no curative drug therapy and the therapeutic approach is aimed at inducing remission and promoting its maintenance. Recent studies have shown that thalidomide is very effective in children with IBD, but the mechanism of action of this drug works still remain ambiguous. The second part of this thesis was focused to obtain a greater knowledge of the mechanisms of action of thalidomide in patients with IBD, in order to identify not only markers of efficacy but also to investigate the molecular causes that trigger the known side effects, including peripheral neuropathy. Transcriptome analysis, performed on blood samples from IBD pediatric patient’s refractory to standard therapies and treated with thalidomide were performed, and 252 differentially expressed genes emerged from RNA-seq, following treatment with the drug. The hypergeometric test on gene ontology (GO) annotations, revealed a series of altered pathways implicated in the mechanism of thalidomide and its main adverse effect, including the eicosanoid and prostaglandin receptor signaling pathway and related to the G protein-coupled adenylate cyclase pathway, and also pathways involved in the nervous system. To validate these transcriptomic results, PGE2 and cAMP were quantified in monocytic Thp-1 cells and THP-1 differentiated in macrophages. Thalidomide caused a significant decrease of PGE2 production in macrophages stimulates with LPS, whereas in THP-1 the drug treatment induced a significative increase in cAMP production. Preliminary studies conducted on neuronal cell line, sh-sy5y, in order to study identify new pathways and genes involved thalidomide induced peripheral neuropathy, revealed that this drug did not have a cytotoxic effect, nor an action at the level of mitochondrial activity. ATP quantification and analysis on intracellular calcium in sh-sy5y revealed that the drug induced an increase in ATP production and in intracellular calcium.

Le malattie infiammatorie croniche intestinali (MICI) sono malattie caratterizzate da una condizione cronica immuno-mediata del tratto gastrointestinale che includono il morbo di Crohn e la rettocolite ulcerosa. Le MICI che colpiscono pazienti pediatrici sono di particolare interesse poiché la loro incidenza è in aumento e, anche se vengono utilizzate strategie farmacologiche diverse, il trattamento ottimale è lungi dall'essere raggiunto. Nella prima parte del progetto di tesi è stato studiato il ruolo dell'lncRNA GAS5, mettendo in evidenza il suo possibile coinvolgimento nel processo di patogenesi del danno tissutale, attraverso la regolazione dei mediatori di danno tissutale, in particolare la MMP-2 e MMP-9 . Dai dati ottenuti sulle biopsie tissutali di pazienti pediatrici affetti da MICI e dagli esperimenti in vitro, è risultato evidente che GAS5 potrebbe essere coinvolto nei processi di danno tissutale e nella determinazione di uno stato infiammatorio cronico che regola l'espressione delle MMP-2 e MMP-9 , metallo proteasi che, in queste malattie, provocano gravi danni alla parete intestinale. L'identificazione di un target molecolare in grado di modulare i livelli di questi enzimi consentirebbe non solo di approfondire le conoscenze sulle cause di un'alterata produzione di MMP-2 e MMP-9 ma anche di sviluppare una strategia farmacologica mirata. Inoltre grazie ad esperimento RNA-IP è stato dimostrato che questo lncRNA era in grado di legarsi e interagire fisicamente con NF-κB, fattore trascrizionale coinvolto nel processo infiammatorio, GAS5 si lega a NF-κB, probabilmente modulando la sua attività trascrizionale, dimostrando ancora una volta il coinvolgimento di questo lncRNA nell'infiammazione e confermando il suo ruolo come biomarcatore dell'infiammazione. Ad oggi nelle MICI non esiste una terapia farmacologica curativa e l'approccio terapeutico è finalizzato a indurre la remissione e a favorirne il mantenimento. Recenti studi hanno dimostrato che la talidomide è molto efficace nei bambini affetti da MICI, ma il meccanismo d'azione di questo farmaco rimane ancora non del tutto chiaro. La seconda parte di questa tesi si è focalizzata ad investigare sui meccanismi d'azione della talidomide nei pazienti con MICI, al fine di identificare non solo marcatori di efficacia ma anche di indagare le cause molecolari che scatenano gli effetti collaterali noti, come la neuropatia periferica. Un’analisi del trascrittoma è stata condotta su campioni di sangue di pazienti pediatrici con MICI refrattari alle terapie standard e in trattamento con talidomide; sono emersi 252 geni differenzialmente espressi dall’analisi di RNA-seq a seguito del trattamento con il farmaco. Il test ipergeometrico basato su annotazioni di Gene Ontology (GO) ha rilevato una serie di pathway alterate implicati nel meccanismo della talidomide e nel suo principale effetto avverso, tra cui la via di signaling del recettore degli ecosanoidi e delle prostaglandine e pathway associata alle proteine G accoppiate alla via dell'adenilato ciclasi, e anche pathway coinvolte nel sistema nervoso. Per validare questi risultati trascrittomici, le PGE2 e cAMP sono stati quantificati in cellule monocitiche Thp-1 e THP-1 differenziate in macrofagi. La talidomide causa una significativa diminuzione della produzione di PGE2 nei macrofagi stimolati con LPS, mentre nel THP-1 il trattamento farmacologico induce un significativo aumento della produzione di cAMP. Studi preliminari condotti sulla linea cellulare neuronale sh-sy5y, al fine di identificare nuove pathway e geni coinvolti nella neuropatia periferica indotta dalla talidomide, hanno rivelato che questo farmaco non ha un effetto citotossico, né un'azione a livello dell’attività mitocondriale. La quantificazione di ATP e del calcio intracellulare nelle sh-sy5y hanno rilevato che il farmaco induce un aumento di entrambi in seguito a trattamento.

IDENTIFICAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI DI MALATTIA E DI RISPOSTA ALLA TERAPIA IN PAZIENTI PEDIATRICI AFFETTI DA MALATTIE INFIAMMATORIE CRONICHE INTESTINALI / Pugnetti, Letizia. - (2021 Oct 15).

IDENTIFICAZIONE DI MARCATORI MOLECOLARI DI MALATTIA E DI RISPOSTA ALLA TERAPIA IN PAZIENTI PEDIATRICI AFFETTI DA MALATTIE INFIAMMATORIE CRONICHE INTESTINALI

PUGNETTI, LETIZIA
2021-10-15

Abstract

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic immune-mediated condition of the gastrointestinal tract that includes Crohn disease and ulcerative colitis. Pediatric IBDs are of particular interest since their incidence is rising and, even if different pharmacological strategies are used, the optimal treatment is far from being achieved. In the first part of the thesis project the role of the lncRNA GAS5 was studied, reporting the possible involvement of this lncRNA in the pathogenesis process of tissue damage, thorough the regulation of mediators of tissue injury, in particular MMP-2 and MMP-9. From data obtained on biopsy tissues of pediatric patients affected by IBD and from in vitro experiments, it is clear that GAS5 could be involved in the processes of tissue damage and in determining a chronic inflammatory state regulating the expression of MMP-2 and MMP-9, proteases that, in IBD cause serious damage to the intestinal wall. The identification of a molecular target capable of modulating the levels of these enzymes would allow not only to deepen the knowledge about the causes of an altered production of MMP-2 and MMP-9 but also to develop a targeted pharmacological strategy. Moreover after a RNA-IP experiment it was shown that this lncRNA was able to bind and interact physically with NF-κB, a transcriptional factor involved in inflammation process, GAS5 bind NF-κB probably modulating its transcriptional activity, demonstrating the involvement of this lncRNA in inflammation and a confirming its role as biomarker of inflammation. To date, there is no curative drug therapy and the therapeutic approach is aimed at inducing remission and promoting its maintenance. Recent studies have shown that thalidomide is very effective in children with IBD, but the mechanism of action of this drug works still remain ambiguous. The second part of this thesis was focused to obtain a greater knowledge of the mechanisms of action of thalidomide in patients with IBD, in order to identify not only markers of efficacy but also to investigate the molecular causes that trigger the known side effects, including peripheral neuropathy. Transcriptome analysis, performed on blood samples from IBD pediatric patient’s refractory to standard therapies and treated with thalidomide were performed, and 252 differentially expressed genes emerged from RNA-seq, following treatment with the drug. The hypergeometric test on gene ontology (GO) annotations, revealed a series of altered pathways implicated in the mechanism of thalidomide and its main adverse effect, including the eicosanoid and prostaglandin receptor signaling pathway and related to the G protein-coupled adenylate cyclase pathway, and also pathways involved in the nervous system. To validate these transcriptomic results, PGE2 and cAMP were quantified in monocytic Thp-1 cells and THP-1 differentiated in macrophages. Thalidomide caused a significant decrease of PGE2 production in macrophages stimulates with LPS, whereas in THP-1 the drug treatment induced a significative increase in cAMP production. Preliminary studies conducted on neuronal cell line, sh-sy5y, in order to study identify new pathways and genes involved thalidomide induced peripheral neuropathy, revealed that this drug did not have a cytotoxic effect, nor an action at the level of mitochondrial activity. ATP quantification and analysis on intracellular calcium in sh-sy5y revealed that the drug induced an increase in ATP production and in intracellular calcium.
15-ott-2021
DECORTI, GIULIANA
33
2019/2020
Settore BIO/14 - Farmacologia
Università degli Studi di Trieste
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Descrizione: Thesis
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