La metilazione del DNA come biomarcatore per la personalizzazione della terapia in pazienti pediatrici

DNA methylation is one of several epigenetic mechanisms that cells use to control gene expression and could be a possible mechanism involved in modulating drug response. In this thesis we evaluated the role of DNA methylation in relation: to glucocorticoid (GC) response in idiopathic nephrotic syndrome (INS) patients, to azathioprine (AZA) pharmacokinetics in early onset pediatric patients with inflammatory bowel disease (IBD) and to methotrexate (MTX) response in pediatric patients with juvenile idiopathic arthritis (JIA). In particular: 1) NLRP3, a member of the NALP3 inflammasome, can activate CASP1 which can cut the glucocorticoid receptor, leading to its inactivation and GC resistance. We found a lower level of NLRP3 promoter methylation in the adult population compared to the pediatric one (p-value: 0.012). Moreover, INS patients presented a lower NLRP3 methylation compared to controls especially in the adult population (2.2 x 10-7). The effect of NLRP3 on GC resistance was assessed by setting up an in vitro model using U937 immortalized monocytes. The activation of the inflammasome pathway produced a reduction in GC sensitivity in U937 cells (p-value: 0.027) due to a lower GC receptor amount inside the cells (p-value < 0.05), evaluated by western blot. 2) AZA is a prodrug used to maintain disease remission in IBD. A higher AZA inactivation metabolism was reported in literature in early onset pediatric patients with IBD, probably due to an age-related higher TPMT activity. Thirty early onset (age < 6) and 90 non-early onset (age between 12 and 18) pediatric patients with IBD have been enrolled and analyzed in terms of cg22736354 methylation, TPMT promoter methylation, AZA active metabolites (TGN), TPMT expression and TPMT activity. AZA dose (mg/kg/day), TGN levels and the ratio between TGN and AZA dose resulted lower in early onset compared to non-early onset patients in a statistically significant way (p-value: 0.0003, 0.01, 0.0005 respectively). A higher TPMT activity was also present in early onset patients (p-value: 0.02). Interestingly, results show a statistically significant difference in the methylation of cg22736354, located in TPMT upstream neighborhood, between early-onset and non-early onset IDB patients (p-value: 4.6 x 10-5) while no differences were seen in TPMT promoter methylation. 3) MTX is an immunosuppressive drug and is the first line therapy for JIA with a high variability in response. The methylation of the CDH4 gene in 71 JIA patients (Italy 24 patients, Kansas City 28 patients and Cincinnati 19 patients) was measured with Illumina methylation EPIC BeadChip array; each cohort was analyzed independently and then data have been pooled together with a metanalysis. From the analysis between CDHs methylation and ACR Pedi (disease improvement index) measured at last follow up visit, 3 differentially methylated positions on the CDH4 gene resulted significant. Moreover, CDH4 gene expression has been analyzed in a cohort of 47 JIA patients available on GEO, in 20 JIA patients’ blood and in different immortalized cellular lines. CDH4 expression resulted very low in all patients. U937 resulted the only immortalized line that expresses the CDH4 gene. In conclusion, this thesis demonstrated the role of DNA methylation as possible biomarker of drug response in 3 different diseases. Our findings suggest that: an epigenetic NLRP3 regulation, mediated by age and disease status, can play a role in GC resistance in INS. Early onset pediatric patients with IBD have a lower cg22736354 methylation that could contribute to the increased AZA inactivation metabolism. The methylation of 3 CpG sites in the CDH4 gene might be a possible biomarker of MTX response in JIA patients.

La metilazione (ME) del DNA è uno dei meccanismi epigenetici che regola l'espressione genica ed è implicato nella modulazione della risposta ai farmaci. In questa tesi è stato valutato il ruolo della ME del DNA in relazione: alla risposta ai glucocorticoidi (GC) in pazienti con sindrome nefrosica idiopatica (SNI), alla farmacocinetica dell'azatioprina (AZA) in pazienti pediatrici con malattia infiammatoria cronica intestinale (MICI) ad esordio precoce (EO), ed alla risposta al metotressato (MTX) in pazienti affetti da artrite idiopatica giovanile (AIG). 1) NLRP3, una proteina dell'inflammosoma NALP3, è in grado di attivare la caspasi-1 che è in grado di tagliare il recettore dei GC, inattivandolo e portando a resistenza ai GC. In questa tesi è stato individuato un livello inferiore di ME del promotore NLRP3 nella popolazione adulta rispetto a quella pediatrica (p-value: 0.012). Inoltre, i pazienti con SNI presentavano una ME di NLRP3 inferiore rispetto ai controlli (2.2 x 10-7). L'effetto di NLRP3 sulla resistenza ai GC è stato confermato con un modello in vitro utilizzando la linea immortalizzata U937. L'attivazione della pathway dell’inflammosoma ha prodotto una riduzione della sensibilità ai GC nelle cellule U937 (p-value: 0.027) a causa di una minore quantità di recettore dei GC all'interno delle cellule (p-value <0.05), valutata mediante western-blot. 2) L’AZA è un profarmaco utilizzato per mantenere la remissione nelle MICI. In letteratura è stato riportato un aumentato metabolismo di inattivazione dell'AZA in pazienti pediatrici EO affetti da MICI, probabilmente a causa di una maggiore attività età-dipendente dell’enzima TPMT. In questa tesi sono stati arruolati 30 pazienti pediatrici EO con MICI (età < 6) e 90 pazienti non-EO (età > 12 e < 18 anni), dei quali sono stati analizzati: ME del sito cg22736354, ME del promotore TPMT, metaboliti dell’AZA (TGN), espressione e attività di TPMT. La dose di AZA, i TGN ed il rapporto TGN/dose di AZA sono risultati inferiori nei pazienti EO rispetto ai pazienti non-EO (p-value: 0.0003, 0.01, 0.0005 rispettivamente). Inoltre, è stata riscontrata una aumentata attività di TPMT nei pazienti EO (p-value 0.02). Inoltre, i nostri risultati mostrano dei livelli significativamente inferiori di ME di cg22736354 (p- valore: 4.6 x 10-5) nei pazienti pediatrici EO. Non sono invece emerse differenze nella ME del promotore di TPMT. 3) Il MTX è un farmaco immunosoppressivo utilizzato come terapia di prima linea per il trattamento dell’AIG, caratterizzato un'elevata variabilità di risposta. In questa tesi è stata analizzata la ME del gene CDH4 in 71 pazienti con JIA (Italia n = 24, Kansas City n = 28 e Cincinnati n = 19) conarray di metilazione Illumina; ogni coorte è stata analizzata indipendentemente e i dati sono stati poi uniti tramite metanalisi. Dall'analisi tra ME del gene CDH4 e ACR Ped calcolato all’ultima visita di controllo, 3 posizioni differenzialmente metilate sul gene CDH4 sono risultate significative. Inoltre, l'espressione di CDH4 è stata analizzata: in una coorte composta da 47 pazienti, disponibile sulla piattaforma GEO; nel sangue di 20 pazienti affetti da AIG e in diverse linee cellulari immortalizzate. L'espressione di CDH4 è risultata molto bassa in tutti i pazienti mentre la linea U937 è risultata l'unica in grado di esprimere il gene CDH4. In conclusione, questa tesi ha dimostrato il ruolo della ME del DNA come possibile biomarcatore della risposta ai farmaci in 3 patologie. I risultati mostrano che: la regolazione epigenetica di NLRP3, mediata dall’età e dallo stato di malattia, può giocare un ruolo importante nella resistenza ai GC in pazienti con SNI. I pazienti pediatrici affetti da MICI EO hanno una ridotta ME di cg22736354 che potrebbe contribuire all'aumentato metabolismo di inattivazione dell’AZA; la ME di 3 siti nel gene CDH4 potrebbe essere un biomarcatore della risposta al MTX in pazienti pediatrici affetti da AIG.