STUDIO GENETICO MOLECOLARE DEL DISTURBO DELLO SPETTRO AUTISTICO NON SINDROMICO E DEI FENOTIPI CORRELATI

Autism spectrum disorders (ASD) are a group of complex neurodevelopmental abnormalities. It is known that genetics has a fundamental but yet not completely understood role in its etiology. There is a strong genetic basis underlying ASD that is highly heterogeneous since several hundred genes have been linked into autism pathogenesis and susceptibility. Interestingly, these genes present a direct role in neuronal functions. Indeed, ASD-related genes are mainly genes with a critical role in synaptic functions. However, the state of the art of the diagnostic processes is based on behavioral criteria. Starting from this aspect and considering the complex genetic architecture of autism, this work aims to evaluate the usefulness of Next-generation sequencing (NGS) in the diagnosis of patients with non-syndromic ASD. We studied and created a gene panel with twenty genes that encode key regulators of synaptic plasticity. In this study we applied a NGS approach for the analysis of 152 pediatric patients referred as non-syndromic ASD phenotypes. Was detected a total of 82 variants distributed in 66 patients. Among the identified variants, we reported a pathogenic variant, a stop codon de novo in CTNNB1. Dysregulation of the core neurodevelopmental pathways is associated with the clinical presentation of ASD, and the canonical WNT/β-catenin (CTNNB1) pathway is one of the pathways involved. We generated expression of a plasmid containing this variant. We evaluated transfection efficiency of expression plasmid by culturing primary hippocampal neurons in vitro. To start evaluating the role of Ctnnb1- Mut in synaptic transmission, with the in utero electroporation (IUE) we transfected pyramidal precursor cells of the embryonic mouse brain. Introduction of the expression of a truncated transcript in vivo and subsequent analysis in ex vivo acute brain slices made from male and female mice revealed a reduction in basal and postsynaptic neurotransmission in hippocampal CA1 neurons. The dysregulation of the β-catenin involves synaptic transmission disorders. Despite the fact that many of the identified variants require further investigation to be considered diseasecausing, these results show the efficiency of the targeted gene panel on the identification of novel and rare variants in patients with non-syndromic ASD. The stop codon de novo in CTNNB1 identified in an individual with non-syndromic ASD did create synaptic transmission changes and altered the basal and postsynaptic neurotransmission in CA1. Therefore, to be carrying stop codon de novo in β-catenin might confer risk for ASD.

I disturbi dello spettro autistico (ASD) sono un gruppo di complesse anomalie dello sviluppo neurologico. È noto che la genetica ha un ruolo fondamentale ma non ancora completamente compreso nella sua eziologia. C'è una forte componente genetica alla base dell'ASD che è altamente eterogenea, poiché diverse centinaia di geni sono stati collegati alla suscettibilità dell'autismo e alla sua patogenesi. È interessante notare che questi geni presentano un ruolo diretto nelle funzioni neuronali. Infatti, i geni correlati all'ASD sono principalmente geni con un ruolo critico nelle funzioni sinaptiche. Tuttavia, i processi diagnostici si basano su criteri comportamentali. Partendo da questo aspetto e considerando la complessa architettura genetica dell'autismo, questo lavoro mira a valutare l'utilità del Next Generation Sequencing (NGS) nella diagnosi di pazienti con ASD non sindromico. Abbiamo studiato e creato un pannello genetico con venti geni che codificano regolatori chiave della plasticità sinaptica. In questo studio abbiamo applicato un approccio NGS per l'analisi di 152 pazienti pediatrici riferiti con fenotipi ASD non sindromici. È stato rilevato un totale di 82 varianti distribuite in 66 pazienti. Tra le varianti identificate, abbiamo riportato una variante patogena, uno stop codon de novo in CTNNB1. La disregolazione delle principali vie dello sviluppo neurologico è associata alla presentazione clinica dell'ASD e la via canonica WNT/β-catenina (CTNNB1) è una delle vie coinvolte. Abbiamo generato l'espressione di un plasmide contenente questa variante. Abbiamo valutato l'efficienza di trasfezione del plasmide di espressione coltivando neuroni ippocampali primari in vitro. Per iniziare a valutare il ruolo di Ctnnb1-Mut nella trasmissione sinaptica, con la in utero electroporation (IUE) abbiamo trasfettato cellule precursori piramidali del cervello embrionale di topo. L'introduzione dell'espressione di un trascritto troncato in vivo e la successiva analisi in sezioni cerebrali ex vivo, realizzate da topi maschi e femmine, hanno rivelato una riduzione della neurotrasmissione basale e postsinaptica nei neuroni CA1 dell'ippocampo. La disregolazione della β-catenina comporta disturbi della trasmissione sinaptica. Nonostante il fatto che molte delle varianti identificate richiedano ulteriori indagini per essere considerate causa di malattia, questi risultati mostrano l'efficienza del pannello genico mirato all’identificazione di varianti geniche in pazienti con ASD non sindromico. Il codone di stop de novo in CTNNB1 identificato in un individuo con ASD non sindromico, ha creato cambiamenti nella trasmissione sinaptica e ha alterato la neurotrasmissione basale e postsinaptica in CA1. Pertanto, portare il codon di stop de novo nella β-catenina potrebbe conferire rischio di ASD.