Il ruolo di PACSIN2 come modulatore dell'autofagia e della citotossicità alle tiopurine: studi su modelli linfoidi ed intestinali

Thiopurines, such as mercaptopurine and azathioprine, are leukotoxic agents used to treat acute lymphoblastic leukemia (ALL) and inflammatory bowel disease (IBD). Thiopurine-methyltransferase (TPMT) is an enzyme involved in thiopurines inactivation; its function is affected mainly by known TPMT polymorphisms and by Protein Kinase C And Casein Kinase Substrate In Neurons 2 (PACSIN2) through a less characterized molecular mechanism. The expression quantitative trait locus (eQTL) rs2413739 variant in PACSIN2 is associated with severe gastrointestinal effects of mercaptopurine in childhood ALL and with azathioprine efficacy in IBD pediatric patients through an uncharacterized mechanism that could be related to autophagy. The present study aims to clarify the role of PACSIN2 in autophagy and on thiopurine cytotoxicity in leukemic and intestinal models. Moreover, this project aims to evaluate the possible effect of both mercaptopurine exposure and PACSIN2 KD on both autophagy and apoptosis induction in an intestinal model. Leukemic (NALM6) and intestinal (LS180) cells with PACSIN2 knock-down (KD) showed higher autophagy, assessed as LC3-II and SQSTM1/P62 amount. Autophagy flux analysis by chloroquine treatment showed increased LC3-II and SQSTM1/P62 amount, suggesting that PACSIN2 affects the early autophagy phases. The inverse association between PACSIN2 amount and autophagy levels was observed also in inflamed compared to non-inflamed colon biopsies of IBD pediatric patients, confirming the in vitro results. No significant association between TPMT amount and autophagy levels was detected, indicating that modulation of autophagy is not the molecular mechanism at the basis of PACSIN2 impact on TPMT activity. Moreover, HPLC-UV analysis showed that PACSIN2 did not affect mercaptopurine pharmacokinetics on intestinal in vitro models. PACSIN2 has a LC3 interacting region (LIR) motif and co-immunoprecipitation analysis confirms that PACSIN2 binds LC3. Transient expression of PACSIN2 with a mutated LIR motif reduced the level of co-immunoprecipitated LC3, showing a role of the LIR motif of PACSIN2 in the interaction. PACSIN2 KD increased mercaptopurine sensitivity in LS180 cells but not in NALM6 cells, suggesting a tissue specific role of PACSIN2 in the intestine after mercaptopurine treatment. Interestingly, mercaptopurine exposure reduced autophagy levels, but PACSIN2 KD counteracted this effect; moreover, both mercaptopurine exposure and PACSIN2 KD are able to stimulate apoptosis. Taken together, these results demonstrate for the first time a clear role of PACSIN2 as an inhibitor of autophagy, putatively through inhibition of autophagosome formation by a protein-protein interaction with LC3-II mediated by a LIR motif present in the PACSIN2 sequence. Moreover, in vitro evidences of the role of PACSIN2 as a modulator of mercaptopurine-induced cytotoxicity in intestinal cells were provided, suggesting that PACSIN2-regulated autophagy levels might influence thiopurine sensitivity.

Le tiopurine, come la mercaptopurina e l'azatioprina, sono agenti leucotossici usati per trattare la leucemia linfoblastica acuta (LLA) e le malattie infiammatorie croniche intestinali (MICI). La tiopurina-metiltransferasi (TPMT) è un enzima coinvolto nell'inattivazione delle tiopurine; la sua funzione è influenzata principalmente dalle varianti geniche di TPMT e di Protein Kinase C And Casein Kinase Substrate In Neurons 2 (PACSIN2). La variante rs2413739 in PACSIN2 è considerata un expression quantitative trait locus (eQTL) associato a gravi effetti gastrointestinali da mercaptopurina in pazienti pediatrici con LLA infantile e all'efficacia dell'azatioprina in pazienti pediatrici affetti da MICI attraverso un meccanismo non caratterizzato, che potrebbe essere correlato all'autofagia. Il presente studio mira a chiarire il ruolo di PACSIN2 nell'autofagia e nella citotossicità delle tiopurine in modelli linfoidi ed intestinali. Inoltre, questo progetto mira a valutare il possibile effetto dell'esposizione a mercaptopurina e del silenziamento di PACSIN2 sia sull'autofagia che sull’apoptosi in un modello cellulare intestinale. I risultati ottenuti sulle linee cellulari immortalizzate linfoidi (NALM6) ed intestinali (LS180) con il silenziamento stabile (knock-down, KD) di PACSIN2 hanno identificato livelli autofagici maggiori, valutati tramite quantificazione dei livelli dei marcatori autofagici LC3-II e SQSTM1/P62, indicando il possibile ruolo di PACSIN2 come modulatore negativo delll’autofagia. È stata svolta un’analisi del flusso autofagico mediante trattamento con clorochina, che ha mostrato un aumento della quantità di LC3-II e SQSTM1/P62, suggerendo il coinvolgimento di PACSIN2 nella regolazione delle prime fasi dell'autofagia. Inoltre, la correlazione inversa tra la quantità di PACSIN2 ed i livelli autofagici è stata osservata anche in un gruppo di biopsie di tratti infiammati del colon rispetto a biopsie di colon non infiammato di pazienti pediatrici con MICI, confermando i risultati ottenuti in vitro. Non è stata rilevata alcuna associazione significativa tra la quantità di TPMT e i livelli dei marcatori autofagici, indicando che la modulazione di PACSIN2 sull'attività di TPMT possa coinvolgere meccanismi diversi dall’autofagia. Inoltre, analisi HPLC-UV hanno dimostrato che PACSIN2 non influenza la farmacocinetica della mercaptopurina sulle linee cellulari intestinali. È stata identificata un’interazione proteina-proteina tra PACSIN2 e LC3, mediata da un dominio di legame a LC3 presente nella sequenza amminoacidica di PACSIN2. Infine, è stato dimostrato che il silenziamento di PACSIN2 è correlato ad una maggior sensibilità alla mercaptopurina nelle cellule LS180 ma non nelle cellule NALM6, suggerendo un ruolo tessuto specifico di PACSIN2 nell'intestino dopo il trattamento con mercaptopurina. È interessante notare come l'esposizione alla mercaptopurina abbia ridotto i livelli autofagici delle cellule LS180 e questo effetto sia meno evidente nelle cellule con il PACSIN2 KD; inoltre, sia l'esposizione alla mercaptopurina che il PACSIN2 KD hanno aumentato i livelli apoptotici delle cellule LS180. I risultati di questo lavoro dimostrano per la prima volta il ruolo di PACSIN2 come inibitore delle prime fasi dell'autofagia, presumibilmente attraverso il legame del dominio LIR di PACSIN2 a LC3-II. Infine, è stato dimostrato il ruolo di PACSIN2 come modulatore della citotossicità alle tiopurine in modelli cellulari immortalizzati intestinali, suggerendo che i livelli di autofagia regolati da PACSIN2 potrebbero influenzare la sensibilità alle tiopurine.