CARATTERIZZAZIONE BIOCHIMICA E FUNZIONALE DELLE PROTEINE TRANSGLUTAMINASI 2 DELLO ZEBRAFISH

Transglutaminase 2 (TG2) is the most ubiquitous member of a family of proteins with the shared feature of catalysing the Ca2+-dependent protein crosslinking. Its gene encodes for 77 kDa protein comprising 4 domains: a N-terminal β-sandwich, responsible for the cell adhesion functions of TG2, a catalytic core, containing the Cys-His-Asp catalytic triad responsible for the crosslinking activity, and two C-terminal β-barrels, important for the regulation of TG2 activity and for its involvement in cell signaling. Indeed, the enzymatic functions of TG2 are regulated by a conformational switch than brings the protein from an extended and active form, favored by high Ca2+ levels, to a closed inactive one, mainly driven by GTP/GDP, where the β-barrels are folded over the catalytic core, shielding the active site and inhibiting the transamidase activity. Upon binding to GTP, TG2 exerts GTPase activity and mediates GPCRs signaling acting as an atypical G protein. TG2 has a widespread distribution in tissues and it localizes both in the ECM with cell adhesion functions, and inside the cells, at the inner surface of the plasma membrane as a signal transducer, but also in the cytosol as well as in several organelles, i.e. the nucleus, where TG2 can regulate gene expression. Given its multiple functions and expression in several cell types, TG2 is involved in many physiological and pathological processes, such as bone development, wound healing, angiogenesis, but also fibrosis, celiac disease and cancer. However, its actual role in biological events is often controversial, as TG2 has often been shown to have opposing effects in several processes, depending on its localization, cell type, or experimental condition. With the aim of laying the foundations of the use of the zebrafish (Danio rerio) as a valid tool for better characterize TG2 functions in vivo, we characterized the enzymatic and functional properties of the zebrafish TG2 proteins. Zebrafish is a well-established animal model for studying vertebrate biology that offers several advantages, such as high genetic conservation with humans, and the ability to spawn weekly hundreds of externally fertilized and optically clear embryos, characterized by rapid development and ease of manipulation. We confirmed the existence of 3 TG2 orthologues (zTGs2) in the zebrafish genome and their actual expression throughout the embryonic development. Then, we produced and purified the zTGs2 as recombinant protein and demonstrated that, like the human enzyme, zTGs2 catalyse a Ca2+ dependent transamidation activity, which can be inhibited with the use of hTG2-specific inhibitors. We also showed in a cell model of human fibroblasts that zTGs2 in the extracellular environment are able to mediate RGD-independent cell adhesion, like hTG2. Ultimately, we transfected and selected zTGs2-overexperessing HEK293 cells, and demonstrated that in this cell line intracellular zTGs2 have a protective role in the apoptotic process, as already shown for hTG2. Overall, our findings suggest that zTGs2 behave in a very similar way as the human orthologue and pave the way for future in vivo studies of TG2 functions in the zebrafish.

La transglutaminasi 2 (TG2) è il membro più ubiquitario di una famiglia di proteine con la caratteristica comune di catalizzare il crosslinking Ca2+-dipendente di substrati proteici. Il suo gene codifica per una proteina di 77 kDa formata da 4 domini: un β-sandwich N-terminale , responsabile delle funzioni di adesione cellulare della TG2, un core catalitico, contenente la triade catalitica Cys-His-Asp responsabile dell'attività di crosslinking, e due β-barrels C-terminali, importanti per la regolazione dell'attività della TG2 e per il suo coinvolgimento nella segnalazione intracellulare. Infatti, l'attività enzimatica della TG2 è regolata da un cambio conformazionale che porta la proteina da una forma estesa ed attiva, favorita da alti livelli di Ca2+, a una forma chiusa ed inattiva, promossa principalmente dalla presenza di GTP/GDP, in cui i due domini C-terminali sono ripiegati sul nucleo catalitico, schermando il sito attivo e inibendo l'attività di transamidazione. Quando si lega al GTP, la TG2 esercita anche attività di GTPasi e media la segnalazione dei GPCRs, agendo come una proteina G non canonica. La TG2 ha una distribuzione diffusa nei tessuti e si localizza sia nella ECM, dove ne regola la composizione e media adesione cellulare, sia all'interno delle cellule, dove può posizionarsi sulla superficie interna della membrana plasmatica e mediare la trasduzione di segnali, ma anche nel citosol e in diversi organelli, come ad esempio nel nucleo, dove la TG2 può regolare l'espressione genica. Date le sue molteplici funzioni e la sua espressione in diversi tipi di cellule, la TG2 è coinvolta in molti processi fisiologici e patologici, come lo sviluppo osseo, la guarigione delle ferite e l'angiogenesi, ma anche la fibrosi, la celiachia e il cancro. Tuttavia, il preciso ruolo svolto dalla TG2 in questi eventi biologici è spesso controverso. Infatti è stato dimostrato come la TG2 possa avere effetti opposti in diversi processi, a seconda della sua localizzazione, del tipo di cellula o della condizione sperimentale. Con l'obiettivo di gettare le basi per l'utilizzo dello zebrafish (Danio rerio) come valido strumento per caratterizzare meglio le funzioni di TG2 in vivo, abbiamo studiato le proprietà enzimatiche e funzionali delle tre TG2 dello zebrafish. Lo zebrafish è un modello animale consolidato per lo studio della biologia dei vertebrati che offre diversi vantaggi, come l'elevata conservazione genetica con l'uomo e la capacità di generare settimanalmente centinaia di embrioni fertilizzati esternamente e trasparenti, caratterizzati da un rapido sviluppo e facilità di manipolazione. Abbiamo confermato l'esistenza di 3 ortologhi della TG2 umana nel genoma di zebrafish (zTGs2) e la loro effettiva espressione durante lo sviluppo embrionale. Abbiamo poi prodotto e purificato le zTGs2 come proteine ricombinanti e abbiamo dimostrato che gli ortologhi dello zebrafish possiedono un'attività Ca2+-dipendente analoga all'attività di transamidazione della TG2 umana, che può essere inibita con l'uso di inibitori hTG2-specifici. Abbiamo anche dimostrato in un modello cellulare di fibroblasti che le zTGs2 nell'ambiente extracellulare sono in grado di mediare adesione cellulare RGD-indipendente, come l'enzima umano. Infine, dopo aver trasfettato e selezionato cellule HEK293 per la sovraespressione delle zTGs2, abbiamo trattato queste cellule con H2O2 e dimostrato che in questa linea cellulare le zTGs2 hanno un effetto anti-apoptotico, come già dimostrato per l'enzima umano. Nel complesso, i nostri risultati suggeriscono che le zTGs2 si comportano in modo molto simile all'ortologo umano, e aprono la strada a futuri studi in vivo sulle funzioni delle TG2 nello zebrafish.