Approcci innovativi per l'elettrofilatura di polisaccaridi nella preparazione di membrane nanostrutturate per il trattamento di ferite difficili

In this PhD thesis, the advantages of electrospun matrices (such as biomimetic architecture, high porosity, and surface area) have been combined with the bioactivity of polysaccharides, focusing on hyaluronic acid (naturally present in the extracellular matrix, or ECM) and on a lactose-derivative of chitosan (CTL), which has been studied for its bioactive properties, including the anti-inflammatory activity in the wound microenvironment, and which is used here for the first time for the preparation of electrospun nanofibers. The limitations associated to polysaccharide electrospinning have been overcome by blending them with a synthetic polymer (polyethylene oxide, PEO) and using a surfactant (namely, Tween® 20) to reduce solution surface tension, thereby producing thin and defect-free nanofibers with a diameter in the range of collagen ECM fibers (50-500 nm). Attention then turned to the more critical step of stabilization in water as the rapid dissolution of the electrospun polysaccharides would hamper their use as wound dressings. For this purpose, various crosslinking methods already investigated in the literature have been tested (such as EDC/NHS, glutaraldehyde, genipin, or heat treatment), all of which being unsuccessful given the highly hydrophilic nature of both hyaluronic acid and CTL. Hence, previously untested crosslinkers in the electrospinning field have been explored, with carbonyldiimidazole (CDI) exhibiting the best results in terms of water stability and fibrous morphology maintenance. Moreover, the ability of the electrospun products to retain a surprisingly high quantity of fluids while favoring water-vapor permeation has been demonstrated, comparing them with a commercial chitosan dressing (Chitoderm®) and non-electrospun polysaccharidic membranes. However, the polysaccharide-based matrix alone did not possess proper stability and consistency to be handled and applied to a wound. For this reason, other polysaccharide-based electrospun systems have been designed, by exploiting two different strategies: i) the layer-by-layer deposition (here also referred to as “coating”) of polysaccharides on a synthetic-based electrospun matrix (namely, polycaprolactone, PCL); ii) the production of a two-layer electrospun membrane with a mechanically stable PCL layer and a bioactive and fast releasing polysaccharide counterpart. The two types of constructs have been characterized in terms of morphology, polysaccharide release kinetics, swelling capacity, and water vapor transmission ability. They revealed good biocompatibility and bioactivity towards human dermal fibroblasts, which showed enhanced healing ability in the presence of polysaccharide-endowed mats. In addition, the antibiotic rifampicin has been added to the PCL layer, to confer the wound dressings antibacterial properties without compromising their biocompatibility. The antibiotic release as well as its inhibitory and bactericidal activity towards Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa, and Escherichia coli have been tested, with higher efficacy against Staphylococci and Pseudomonas aeruginosa.

Nella presente tesi di dottorato, i vantaggi offerti da matrici elettrofilate (come l’architettura biomimetica, l’elevata porosità e l’area superficiale) sono stati combinati con la bioattività dei polisaccaridi, in particolare con quella dell’acido ialuronico (naturalmente presente nella matrice extracellulare) e di un chitosano modificato con gruppi lattosidici (CTL), studiato per le sue proprietà bioattive, tra cui l’attività antiinfiammatoria nel microambiente della ferita, e qui usato per la prima volta per l’elettrofilatura di nanofibre. Le limitazioni correlate all’elettrofilatura dei polisaccaridi sono state superate grazie all’aggiunta di un polimero sintetico (l’ossido di polietilene, PEO) e di un surfattante (il Tween® 20), utilizzato per ridurre la tensione superficiale in modo da ottenere nanofibre sottili, prive di difetti e con un diametro paragonabile a quello delle fibre di collagene della matrice extracellulare (50-500 nm). In seguito, l’attenzione si è spostata verso il passaggio più critico della stabilizzazione in acqua, poiché i prodotti elettrofilati a base di polisaccaridi vanno incontro ad una rapida dissoluzione, impedendone l’utilizzo quali medicazioni per ferite croniche. Per tale ragione, diversi metodi di reticolazione già studiati in letteratura sono stati testati (come EDC/NHS, glutaraldeide, genipina o trattamento al calore), rivelandosi tuttavia tutti infruttuosi a causa della natura fortemente idrofilica dell’acido ialuronico e del CTL. Pertanto, nuovi agenti reticolanti mai impiegati nel campo dell’elettrofilatura sono stati studiati; tra questi, il carbonildiimidazolo (CDI) ha dato i migliori risultati in termini di stabilità in acqua e mantenimento della morfologia fibrosa. Inoltre, è stata dimostrata la sorprendente abilità dei prodotti elettrofilati di trattenere grandi quantità di fluidi favorendo al contempo la permeazione del vapore acqueo, tramite una comparazione con una medicazione già presente in commercio a base di chitosano (il Chitoderm®) e con membrane polisaccaridiche non elettrofilate. Nonostante ciò, la matrice a base di soli polisaccaridi non possiede una resistenza meccanica e consistenza che ne consentano la maneggiabilità e l’applicazione su una ferita. Per questo motivo, sono stati disegnati altri sistemi elettrofilati a base di polisaccaridi, sfruttando due diverse strategie: i) la deposizione strato per strato (anche detta coating) dei polisaccaridi su una matrice elettrofilata a base sintetica costituita da policaprolattone (PCL); ii) la produzione di una membrana elettrofilata a due strati, formata da uno strato meccanicamente stabile di PCL e uno strato bioattivo e a rilascio rapido a base di polisaccaridi. Queste due tipologie di strutture sono state caratterizzate per la loro morfologia, per le cinetiche di rilascio dei polisaccaridi, la capacità di assorbire fluidi e la permeabilità al vapore acqueo. Hanno, inoltre, rivelato una buona biocompatibilità e bioattività nei confronti di fibroblasti umani del derma, la cui capacità di rigenerazione era incentivata dalla presenza delle membrane contenenti polisaccaridi. In aggiunta, l’antibiotico rifampicina è stato addizionato allo strato di PCL, per conferire a queste medicazioni anche proprietà antibatteriche, senza però alterarne la biocompatibilità. Il rilascio di antibiotico così come l’attività antibatterica contro Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Pseudomonas aeruginosa ed Escherichia coli sono stati testati, mostrando una maggiore efficacia nei confronti degli Stafilococchi e di Pseudomonas aeruginosa.