Sviluppo di protocolli analitici per lo studio della farmacocinetica delle tiopurine con spettroscopia Raman amplificata da superfici

Thiopurine drugs azathioprine (AZA), mercaptopurine (MP) and thioguanine (TG) are immunomodulatory antimetabolites used for the treatment of lymphoblastic leukemia, autoimmune disorders and for anti-rejection therapy. They can present dose-dependent adverse effects in patients, related to inter-individual differences in the activity of enzymes involved in their biotransformation. Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) spectroscopy is an analytical method that can be used to detect the presence of low-abundance molecules and to analyze the composition of complex biological matrices, offering many advantages such as affordable cost, short analysis times and easy sample preparation, in comparison to the most employed methods for pharmacokinetic analysis of drugs, such as HPLC and mass spectrometry. We applied the SERS technique to evaluate thiopurines pharmacokinetics in human immortalized hepatocytes cell line (IHH wild-type), after in vitro treatment with AZA and MP. The drug treatment caused considerable changes from the SERS spectrum of the untreated lysates and it was possible to follow the trend of formation of metabolites over time, also evaluating the influence of the activity level of the enzyme inosine triphosphate pyrophosphatase (ITPA) on thiopurine metabolism. Results seemed to confirm a difference in the outcome of thiopurine in vitro metabolism in the cytosol of IHH presenting an over expression of ITPA, in terms of higher signal intensity for thioguanosine nucleotides (TGN) and thioinosinic metabolites. Subsequently, a human B-lymphoblastoid cell line (NALM6) with the over expression of TPMT (NALM6 TPMT*1) was used to evaluate the influences of TPMT activity level on thiopurine biotransformation after in vitro treatment with MP and TG. Samples have been also analyzed by mass spectrometry in collaboration with Bosch Institute of Clinical Pharmacology (Germany). SERS and mass spectrometry analysis underlined decreased levels of TGN and increased levels of methylated metabolites when TPMT was over expressed, both after MP and TG treatment. Lastly, we aimed to detect TGN in biological matrices different from cell lysate, in particular in erythrocyte lysates, and to detect thioguanine incorporated in DNA (as deoxy-thioguanosine) after in vitro treatment of NALM6 MOCK with the aim to investigate if SERS technique could be useful to analyze quali-quantitatively TGN at a concentration beneficial for TDM or for the evaluation of patients’ compliance to thiopurine therapy. A calibration line of TGMP in erythrocytes was obtained, with a R-squared of 0.97. Finally, our findings confirmed SERS is able to discriminate natural nucleoside signals from deoxy-thioguanosine signal. Moreover it was possible to detect the incorporation of thioguanine into DNA of NALM6 MOCK after in vitro treatment of 24 and 48 hours. In the future, these SERS protocols could be subjected to a validation process by comparison to validated quantitative methods.

I farmaci tiopurinici azatioprina (AZA), mercaptopurina (MP) e tioguanina (TG) sono antimetaboliti immunomodulatori utilizzati per il trattamento della leucemia linfoblastica, delle malattie autoimmuni e per la terapia antirigetto. Possono presentare effetti avversi dose-dipendenti nei pazienti, correlati a differenze interindividuali nell'attività degli enzimi coinvolti nella loro biotrasformazione. La spettroscopia Surface Enhanced Raman Scattering (SERS) è un metodo analitico che può essere utilizzato per rilevare la presenza di molecole a bassa abbondanza e per analizzare la composizione di matrici biologiche complesse, offrendo molti vantaggi come costi accessibili, tempi di analisi brevi e facile preparazione del campione , rispetto ai metodi più utilizzati per l'analisi farmacocinetica dei farmaci, come l'HPLC e la spettrometria di massa. In questo lavoro di tesi, abbiamo applicato la tecnica SERS per valutare la farmacocinetica delle tiopurine in linee cellulari di epatociti umani immortalizzati (IHH wild-type), dopo trattamento in vitro con AZA e MP. Il trattamento farmacologico ha determinato notevoli variazioni dello spettro SERS dei lisati non trattati ed è stato possibile seguire l'andamento di formazione dei metaboliti nel tempo, valutando anche l'influenza del livello di attività dell'enzima inosina trifosfato pirofosfatasi (ITPA) sul metabolismo delle tiopurine. I risultati sembrano confermare una differenza nell'esito del metabolismo in vitro delle tiopurine delle IHH che presentando una sovraespressione di ITPA, in termini di maggiore intensità del segnale per i nucleotidi della tioguanosina (TGN) e per i metaboliti tioinosinici nel citosol. Successivamente, una linea cellulare B-linfoblastoide umana (NALM6) con la sovraespressione di TPMT (NALM6 TPMT*1) è stata utilizzata per valutare le influenze del livello di attività di TPMT sulla biotrasformazione della tiopurina dopo il trattamento in vitro con MP e TG. I campioni sono stati analizzati anche mediante spettrometria di massa in collaborazione con il Bosch Institute of Clinical Pharmacology (Germania). L'analisi SERS e la spettrometria di massa hanno evidenziato livelli ridotti di TGN e livelli aumentati di metaboliti metilati quando il TPMT era sovraespresso, sia dopo il trattamento con MP che con TG. Infine, abbiamo mirato a rilevare i TGN in matrici biologiche diverse dal lisato cellulare, in particolare nei lisati di eritrociti, e a rilevare la tioguanina incorporata nel DNA (come deossi-tioguanosina) dopo il trattamento in vitro delle NALM6 MOCK con l'obiettivo di indagare se la tecnica SERS potesse essere utile per analizzare quali-quantitativamente i TGN ad una concentrazione benefica per il TDM o per la valutazione della compliance dei pazienti alla terapia con tiopurine. È stata ottenuta una linea di calibrazione del TGMP negli eritrociti, con un R-quadrato di 0,97. Infine, i nostri risultati hanno confermato che SERS è in grado di discriminare i segnali dei nucleosidi naturali dal segnale deossi-tioguanosina. Inoltre è stato possibile rilevare l'incorporazione della tioguanina nel DNA di NALM6 MOCK dopo trattamento in vitro di 24 e 48 ore. In futuro, questi protocolli SERS potrebbero essere sottoposti a un processo di convalida rispetto a metodi quantitativi convalidati.