The adult heart is not able to regenerate or revascularize itself after ischemic damage. In the past decade, several strategies have been considered to either replace lost cardiomyocytes (CMs) or promote autologous CM proliferation, unfortunately, none of these approaches have successfully reached the clinical phase. Recent observations suggest the important role of endothelial cells (ECs), as key regulators of both tissue homeostasis and regeneration in several organs, such as lung, liver, pancreas and muscle. Unlike the neonatal heart, the adult heart is not able to revascularize itself after ischemic damage neither after pro-angiogenic stimuli. Currently, scant information is available on the mechanisms blocking angiogenesis in the adult heart and very little is known about the EC-CM interaction. Because of their close proximity, these cells can communicate through either the secretion of paracrine signals or direct cell-to-cell contact. While several studies indicate that ECs provide multiple autocrine and paracrine signals controlling cardiac function, such as myocardial growth and CM contractility and homeostasis, much less is known about the signals produced by CMs, able to regulate EC biology. This project intends to investigate whether CMs, which lose their proliferation potential one week after birth, send inhibitory signals that also block the angiogenic potential of adult cardiac ECs. Using different co-culture methods, we observed that adult CMs indeed sent inhibitory signals, that blocked cardiac EC proliferation, whereas neonatal CMs did not. To identify these anti-angiogenic factors, we exploited existing RNA sequencing dataset to generate the interactome between ligands produced by CMs and receptors expressed by cardiac ECs. We observed that 20 CM ligands establish 118 putative interactions with 74 EC receptors. Complementary approaches of loss and gain of function studies led to identification of potentially anti-angiogenic interactors. The knockout of CM interactors rescued the angiogenic potential of the heart in response to VEGF. Thus, interfering with CM-EC cross-talk might offer new therapeutic avenues to promote cardiac angiogenesis. Starting from the observation that adult, but not neonatal, CMs inhibit EC proliferation, we explored whether partial CM de-differentiation could in turn rescue the angiogenic potential of the adult heart. Therefore, we contextually delivered miR199a, the most potent pro-proliferative miRNA, in combination with VEGF-A using adeno-associated viral vectors. This results in significant EC proliferation and neo-vessel formation, confirming that partial CM de-differentiation unleashes the angiogenic potential of cardiac ECs. A third hypothesis to explain the low angiogenic potential of the adult heart is that the cardiac endothelium undergoes cell autonomous modifications that reduce its capacity to respond to pro-angiogenic stimuli during post-natal development. Among the factors possibly involved in this process, VEGF receptor-1 (VEGFR-1) is a promising candidate acting as a "decoy" molecule that prevents the binding of VEGF-A to the main angiogenic receptor VEGFR-2. We observed that VEGFR-1 expression increases with age in cardiac ECs, CMs and immune cells. To investigate the possible role of VEGFR-1 in regulating cardiac angiogenesis, we generated three genetically modified mice in which we knocked-out VEGFR-1 in ECs, CMs and resident immune cells respectively. Upon VEGF overexpression, VEGFR-1 knock out in ECs, but not in both CMs and resident immune cells, increased cardiac angiogenesis. These results confirm the cell-autonomous role of VEGFR-1 in inhibiting EC proliferation in the heart. Collectively, this work has shed light on three non-mutually exclusive mechanisms that may be responsible for the low angiogenic potential of the adult heart and could be exploited to develop innovative therapies to foster cardiac regeneration and revascularization.

Il cuore adulto non è in grado di rigenerarsi o rivascolarizzarsi dopo un danno ischemico. Nell'ultimo decennio sono state prese in considerazione diverse strategie per sostituire i cardiomiociti (CM) persi o per promuovere la proliferazione di CM autologhi. Purtroppo, nessuno di questi approcci ha raggiunto con successo la fase clinica. Recenti studi suggeriscono il ruolo importante delle cellule endoteliali (EC), come regolatori chiave sia dell'omeostasi tissutale che della rigenerazione in diversi organi, come polmone, fegato, pancreas e muscolo. A differenza del cuore neonatale, il cuore adulto non è in grado di rivascolarizzarsi dopo un danno ischemico né dopo stimoli pro-angiogenici. Attualmente, sono disponibili poche informazioni sui meccanismi che bloccano l'angiogenesi nel cuore adulto e si sa molto poco sull'interazione EC-CM. Questo progetto intende indagare se i CM, che perdono il loro potenziale proliferativo una settimana dopo la nascita, inviano segnali inibitori che bloccano anche il potenziale angiogenico delle EC cardiache adulte. Utilizzando diversi metodi di co-coltura, abbiamo osservato che i CM adulti inviano segnali inibitori, che bloccano la proliferazione delle EC cardiache, mentre i CM neonatali non lo fanno. Per identificare i fattori anti-angiogenici, abbiamo sfruttato dati di sequenziamento dell'RNA per generare un interattoma che collega i ligandi prodotti dai CM con i recettori espressi dalle EC cardiache. Abbiamo osservato che 20 ligandi dei CM stabiliscono 118 possibili interazioni con 74 recettori delle EC. Approcci complementari di studi di perdita e guadagno di funzione hanno portato all'identificazione di potenziali interattori anti-angiogenici. Il knockout degli interattori ha ripristinato il potenziale angiogenico del cuore in risposta al VEGF. Partendo dall'osservazione che i CM adulti, ma non i neonatali, inibiscono la proliferazione delle EC, abbiamo testato se promuovere il parziale de-differenziazione dei CM potesse a sua volta ripristinare il potenziale angiogenico del cuore adulto. Pertanto, abbiamo somministrato contestualmente il miR199a, il miRNA con capacità pro-proliferative più potente, in combinazione con il VEGF-A utilizzando vettori virali adeno-associati. A seguito del co-trattamento abbiamo osservato una significativa proliferazione delle EC e la formazione di nuovi vasi sanguigni, confermando che il parziale de-differenziazione dei CM fa riacquistare il potenziale angiogenico alle EC cardiache. Una terza ipotesi per spiegare il basso potenziale angiogenico del cuore adulto è che l'endotelio cardiaco subisca modifiche cellulari autonome che riducono la sua capacità di rispondere a stimoli pro-angiogenici durante lo sviluppo postnatale. Tra i fattori che potrebbero essere coinvolti in questo processo, il recettore-1 del VEGF (VEGFR-1) è un candidato promettente, in quanto è noto inibire l'angiogenesi agendo come una molecola "esca" che impedisce il legame del VEGF-A al principale recettore angiogenico VEGFR-2. Abbiamo osservato che l'espressione di VEGFR-1 aumenta con l'età nelle EC, nelle CM e nelle cellule immunitarie. Per indagare il possibile ruolo di VEGFR-1 nella regolazione dell'angiogenesi cardiaca, abbiamo generato tre topi geneticamente modificati in cui abbiamo eliminato VEGFR-1 rispettivamente nelle EC, nelle CM e nelle cellule immunitarie residenti del cuore. A seguito della sovraespressione di VEGF, il knock-out di VEGFR-1 nelle EC, ma non nei CM e nelle cellule immunitarie residenti, ha aumentato l'angiogenesi cardiaca. Questi risultati confermano il ruolo cellulare-autonomo di VEGFR-1 nell'inibire la proliferazione delle EC nel cuore adulto. Questo lavoro ha fatto luce su tre meccanismi non mutuamente esclusivi che potrebbero essere responsabili del basso potenziale angiogenico del cuore adulto e che potrebbero essere sfruttati per sviluppare terapie innovative per favorire la rigenerazione e rivascolarizzazione cardiaca.

Studio del cross-talk tra cardiomiociti e cellule endoteliali per promuovere la rivascolarizzazione e la rigenerazione cardiaca / Vuerich, Roman. - (2024 Mar 21).

Studio del cross-talk tra cardiomiociti e cellule endoteliali per promuovere la rivascolarizzazione e la rigenerazione cardiaca

VUERICH, ROMAN
2024-03-21

Abstract

The adult heart is not able to regenerate or revascularize itself after ischemic damage. In the past decade, several strategies have been considered to either replace lost cardiomyocytes (CMs) or promote autologous CM proliferation, unfortunately, none of these approaches have successfully reached the clinical phase. Recent observations suggest the important role of endothelial cells (ECs), as key regulators of both tissue homeostasis and regeneration in several organs, such as lung, liver, pancreas and muscle. Unlike the neonatal heart, the adult heart is not able to revascularize itself after ischemic damage neither after pro-angiogenic stimuli. Currently, scant information is available on the mechanisms blocking angiogenesis in the adult heart and very little is known about the EC-CM interaction. Because of their close proximity, these cells can communicate through either the secretion of paracrine signals or direct cell-to-cell contact. While several studies indicate that ECs provide multiple autocrine and paracrine signals controlling cardiac function, such as myocardial growth and CM contractility and homeostasis, much less is known about the signals produced by CMs, able to regulate EC biology. This project intends to investigate whether CMs, which lose their proliferation potential one week after birth, send inhibitory signals that also block the angiogenic potential of adult cardiac ECs. Using different co-culture methods, we observed that adult CMs indeed sent inhibitory signals, that blocked cardiac EC proliferation, whereas neonatal CMs did not. To identify these anti-angiogenic factors, we exploited existing RNA sequencing dataset to generate the interactome between ligands produced by CMs and receptors expressed by cardiac ECs. We observed that 20 CM ligands establish 118 putative interactions with 74 EC receptors. Complementary approaches of loss and gain of function studies led to identification of potentially anti-angiogenic interactors. The knockout of CM interactors rescued the angiogenic potential of the heart in response to VEGF. Thus, interfering with CM-EC cross-talk might offer new therapeutic avenues to promote cardiac angiogenesis. Starting from the observation that adult, but not neonatal, CMs inhibit EC proliferation, we explored whether partial CM de-differentiation could in turn rescue the angiogenic potential of the adult heart. Therefore, we contextually delivered miR199a, the most potent pro-proliferative miRNA, in combination with VEGF-A using adeno-associated viral vectors. This results in significant EC proliferation and neo-vessel formation, confirming that partial CM de-differentiation unleashes the angiogenic potential of cardiac ECs. A third hypothesis to explain the low angiogenic potential of the adult heart is that the cardiac endothelium undergoes cell autonomous modifications that reduce its capacity to respond to pro-angiogenic stimuli during post-natal development. Among the factors possibly involved in this process, VEGF receptor-1 (VEGFR-1) is a promising candidate acting as a "decoy" molecule that prevents the binding of VEGF-A to the main angiogenic receptor VEGFR-2. We observed that VEGFR-1 expression increases with age in cardiac ECs, CMs and immune cells. To investigate the possible role of VEGFR-1 in regulating cardiac angiogenesis, we generated three genetically modified mice in which we knocked-out VEGFR-1 in ECs, CMs and resident immune cells respectively. Upon VEGF overexpression, VEGFR-1 knock out in ECs, but not in both CMs and resident immune cells, increased cardiac angiogenesis. These results confirm the cell-autonomous role of VEGFR-1 in inhibiting EC proliferation in the heart. Collectively, this work has shed light on three non-mutually exclusive mechanisms that may be responsible for the low angiogenic potential of the adult heart and could be exploited to develop innovative therapies to foster cardiac regeneration and revascularization.
21-mar-2024
ZACCHIGNA, SERENA
36
2022/2023
Settore BIO/11 - Biologia Molecolare
Università degli Studi di Trieste
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embargo fino al 21/03/2025

Descrizione: Tesi definitiva Roman Vuerich
Tipologia: Tesi di dottorato
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Utilizza questo identificativo per citare o creare un link a questo documento: https://hdl.handle.net/11368/3071642
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