approccio integrativo in drug discovey contro il SARS-CoV2: studio biochimico e biofisico sulla proteasi Papain-like

Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV2), the etiological agent of Covid-19 syndrome, caused one of the most impacting pandemics in human history. Vaccination campaigns offered the solution to the global emergency, but up to now only a few treatments of the disease have been approved. Among potential pharmacological targets of the SARS-CoV2, the Cysteine proteases are one of the most promising, due to their essential role in viral replication and additional functions in the infection development: the more explored Main protease (Mpro) and the Papain-like protease (PLpro). The second one is a domain of the sizeable non-structural protein 3 (nsp3) and besides the cleavage of the viral polyprotein pp1a in three sites, shows deISGylating and deUbiquitinating activity. PLpro represents indeed one of the main viral protecting systems against the immune response, interfering with the cytokines pathways regulated by the Ubiquitin and ISG15 modification system. Despite the number of drug screenings performed on this target, only a few molecules were validated as inhibitors. In this thesis are presented our efforts to identify ensured repurposing inhibitors of this enzyme and the characterization of differences between the commonly used construct of the PLpro and the double-domain construct PLpro_NAB, containing the Nucleic-Acid Binding domain of nsp3, both produced in the Elettra Protein Facility. The project was developed in collaboration with valuable partners who provided their skills, leading to the identification of interesting repurposing inhibitors. After critically evaluating the first results, applying an integrative approach of biochemical, computer-aided and biophysical techniques, we elucidated the mechanism of action of false-positive compounds which at first looked promising, highlighting instead a real inhibitor, the CPI-169. The μM affinity was suitable to be studied by ligand-based NMR techniques, which allowed the validation of the computational and biochemical readouts. The interaction with the preferred human substrate of the PLpro, the ISG15, was also investigated in this project. The production of ISG15 and its precursor (proISG15) was necessary to highlight interesting discrepancies in the binding and catalytic activity of the PLpro_NAB mutants S466R and T467K, two mutations discovered in the Delta-variant of SARS-CoV2. Our results show that the point mutations located on the NAB domain alter the neighbour domain, the PLpro, and how a single point mutation on another domain of the nsp3 can also affect the PLpro.

Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 (SARS-CoV2), l'agente eziologico della sindrome Covid-19, ha causato una delle pandemie più impattanti della storia umana. Le campagne di vaccinazione hanno offerto la soluzione all'emergenza globale, ma finora sono stati approvati solo pochi trattamenti della malattia. Tra i potenziali bersagli farmacologici del SARS-CoV2, le cistein-proteasi sono tra le più promettenti, grazie al loro ruolo essenziale nella replicazione virale e per le loro funzioni aggiuntive nello sviluppo dell'infezione: la più studiata Main protease (Mpro) e la Papain-like protease (PLpro). La seconda è un dominio della proteina non strutturale 3 (nsp3) e, oltre al clivaggio della poli-proteina virale pp1a in tre siti, mostra attività deISGilasica e deUbiquitinasica. La PLpro rappresenta infatti uno dei principali sistemi di protezione del coronavirus contro la risposta immunitaria, interferendo con le vie delle citochine regolate dal sistema di modificazione dell'Ubiquitina e dell'ISG15. Nonostante il numero di screening farmacologici effettuati su questo target, solo poche molecole sono state validate come inibitori. In questa tesi vengono presentati i nostri sforzi per identificare inibitori accertati di questo enzima e la caratterizzazione delle differenze tra il costrutto comunemente usato della PLpro e il costrutto a doppio dominio PLpro_NAB, contenente il Nucleic-Acid Binding domain dell’nsp3, entrambi prodotti nella protein facility di Elettra. Il progetto è stato sviluppato in collaborazione con validi partner che hanno messo a disposizione le loro competenze, portando all'identificazione di interessanti inibitori di riposizionamento. Dopo aver valutato criticamente i primi risultati, applicando un approccio integrativo di tecniche biochimiche, computazionali e biofisiche, abbiamo delucidato il meccanismo d'azione di composti falsi-positivi che all'inizio sembravano promettenti, evidenziando invece un vero inibitore, il CPI-169. Grazie all'affinità μM della molecola, è stato possibile studiare l’interazione con tecniche di ligand-based NMR, che hanno permesso di validare i risultati computazionali e biochimici. In questo progetto è stata investigata anche l'interazione con il substrato umano di elezione della PLpro, l'ISG15. La produzione di ISG15 e del suo precursore (proISG15) è stata necessaria per evidenziare interessanti differenze nel legame e nell'attività catalitica dei mutanti S466R e T467K della PLpro_NAB, due mutazioni scoperte nella variante Delta del SARS-CoV2. Le nostre osservazioni dimostrano che le mutazioni puntiformi localizzate sul dominio NAB alterano il dominio vicino, la PLpro, e come una singola mutazione puntiforme su un altro dominio dell'nsp3 possa influenzare anche il PLpro.