SELF-ASSEMBLY OF MINIMALISTIC PHENYLALANINE DERIVATIVES INTO SUPRAMOLECULAR HYDROGELS

Biodegradable nanomaterials based on short-peptide building blocks have raised an increasing interest in research over the years. They present several advantages (i.e., biocompatibility, chemical diversity, low cost) relative to other types of materials, and there is a large scope to study minimalistic short sequences as active building blocks for biomaterials, with single amino acids and dipeptides standing out as ideal candidates, athough prediction of their supramolecular behaviour is very challenging. This PhD thesis aims to fill this gap firstly describing the self-assembly of a N-capped phenylalanine (Phe) derivative into a transparent gel under physiological conditions with promising antimicrobial activity and biocompatibility in vitro. Next, the substitution of the N-cap with another hydrophobic amino acid (i.e., Phe, Leu, Ile, or Val) has been explored as a preferable strategy towards biocompatible self-assembling dipeptides, and effects of amino acid chirality over gelation has been studied. Heterochirality revealed to be a successful strategy to control the hierarchical assembly of dipeptides, especially in the case of Phe-Phe, and to promote self-assembly in water through increased peptide hydrophobicity. As self-assembly is a cooperative process, small structural sequence differences (i.e., branching of the aliphatic amino acid sidechain for the regioisomers Leu and Ile) can be amplified and lead to significant supramolecular differences. Furthermore, halogenation was studied for its influence on the supramolecular organization of D-Phe-L-Phe. Peptides were synthesized by Fmoc-based solid-phase peptide synthesis, purified by reverse-phase HPLC and characterized by 1H-NMR, 13C-NMR and ESI-MS. Self-assembly was probed under physiological conditions (i.e., phosphate buffered solutions) and the supramolecular behaviour was investigated by means of rheology, circular dichroism (CD), Fourier-transformed infrared spectroscopy (FT-IR), Thioflavin T fluorescence, optical imaging, transmission electron microscopy (TEM), powder and single-crystal X-ray diffraction (XRD), visible and UV-resonant Raman spectroscopy. Finally, biocompatibility was assayed qualitatively (live/dead) and quantitatively (MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide). Overall, this PhD thesis allows to delineate design rules for the self-assembly of very simple building blocks based on 1-2 amino acids into biocompatible biomaterials and outlines several examples of supramolecular water-channels and hydrogels with potential applications in medicine.

Nel corso degli anni, i materiali nanostrutturati costituiti da piccoli peptidi e con una buona biodegradabilità hanno suscitato un notevole interesse nella ricerca. Grazie ai numerosi vantaggi che presentano rispetto ad altri tipi di materiali (ad es. biocompatibilità, versatilità chimica di composizione e semplicità di preparazione con bassi costi e su grande scala), si è assistito ad un crescente ed attivo interesse verso lo sviluppo di biomateriali di natura peptidica a partire da sequenze il più semplici e brevi possibili, quali singoli amminoacidi o dipeptidi, secondo un approccio di tipo minimalista. Questa tesi di dottorato, per prima cosa, descrive la capacità di un derivato dell’amminoacido fenilalanina, protetta all’N-terminale in posizione para con un gruppo nitrobenzoile, di auto-assemblarsi in condizioni fisiologiche per formare un idrogel trasparente. Studi preliminari in vitro, hanno rivelato per questo composto una promettente attività antimicrobica ed una buona biocompatibilità verso colture cellulari di mammifero. Successivamente, è stato investigato l’effetto della sostituzione del gruppo N-terminale della fenilalanina con un altro amminoacido di natura idrofobica, quale fenilalanina, leucina, isoleucina o valina, considerando questa sostituzione come una strategia promettente per ottenere biomateriali a partire da dipeptidi capaci di auto-organizzarsi. È stata inoltre esplorata l’influenza della chiralità nei singoli amino acidi, sulla capacità di questi dipeptidi di formare idrogeli. L’eterochiralità si è rivelata una promettente strategia sia per guidare l’organizzazione gerarchica di piccole molecole quali i dipeptidi, specialmente nel caso della difenilalanina, sia per favorirne la loro auto-organizzazione in acqua, aumentando l’idrofobicità della sequenza peptidica. Poichè il fenomeno di auto-organizzazione è un processo cooperativo, anche minime differenze strutturali nella sequenza peptidica, quali la diversa ramificazione della catena alifatica nei tre regioisomeri leucina, isoleucina e norleucina, può essere amplificata e portare a significative differenze a livello sopramolecolare. In questa tesi, infine, è stata investigata anche la possibile influenza dell’alogenazione sull’organizzazione sopramolecolare della difenilalanina eterochirale. I peptidi sono stati sintetizzati in fase solida, purificati mediante HPLC in fase inversa e caratterizzati a livello molecolare tramite 1H-NMR, 13C-NMR e studi di massa ESI-MS. La capacità di ogni dipeptide sintetizzato di auto-organizzarsi e formare degli idrogeli è stata testata in condizioni fisiologiche (es. soluzioni di tampone fosfato) ed il comportamento sopramolecolare è stato investigato tramite l’utilizzo di diverse tecniche, quali analisi di reologia, dicroismo circolare (CD), spettroscopia infrarossa (FT-IR), saggi di fluorescenza (Th-T) amiloide, microscopia ottica ed a trasmissione elettronica (TEM), diffrazione a raggi X (XRD) su singolo cristallo e su polvere e spettroscopia visibile ed UV-Raman. Infine, la biocompatibilità di questi composti è stata testata in vitro attraverso saggi di citotossicità sia di tipo qualitativo (live/dead) che quantitativo (MTT, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) su culture cellulari di mammifero. Complessivamente, questa tesi di dottorato consente di definire le regole chiave che guidano l’auto-organizzazione di semplici e piccole molecole, costituite da 1 o 2 amminoacidi, per ottenere biomateriali con ideali caratteristiche di biodegradabilità e biocompatibilità. Inoltre, molti dei sistemi studiati in questa tesi dimostrano la loro capacità di organizzarsi in maniera ordinata a formare interessanti strutture a canale ed idrogel, con promettenti e potenziali applicazioni future nel campo della biomedicina.