Sviluppo di strategie di riconoscimento per il rilevamento di fenoli bioattivi in olio d'oliva e caffè

The aim of the PhD project has been the development of sensing elements targeting phenolic compounds from coffee – i.e. chlorogenic acid (CGA) and caffeic acid - and olive oil- i.e. hydroxytyrosol and tyrosol- for quality monitoring purposes. The focus has been that of developing covalent strategies for target molecules (TM) monitoring, exploiting optical techniques (absorbance and fluorescence) for signal transduction. The three exploited reactions have been: -green trihydroxybenzacridine (TBA) pigments formation; -boronic esters formation; -diazo-coupling reaction. TBA pigment formation is a reaction involving primary amino groups and caffeic acid esters -such as CGA-, leading to formation of green compounds. The reaction has been initially studied on the amino acid lysine and CGA, using it to quantify the TM both at the endpoint of the reaction (after 24 hours) and working in kinetic mode, monitoring the first 15 minutes of reaction, obtaining very good results. Then, the reaction has been applied to the synthesis of peptides containing the amino acid lysine: for one of them, an improved performance could be obtained with respect to the starting amino acid. The reaction has been applied also to the synthesis of polymeric films containing amino monomers capable of forming TBA pigments with CGA: after testing the reactivity of several polymeric compositions, the best performing one has been used to compare the performance in CGA quantification of laboratory instrumentation and different portable devices, obtaining promising results for the latter. Also, new fluorescence properties of the TBA pigment have been investigated. Considering boronic acid reaction, the focus was that of targeting in particular ortho-diphenolic compounds capable of forming stable cyclic boronic esters. For this purpose, two fluorophores containing a boronic acid moiety and capable of modulating their fluorescence upon target molecules binding have been tested. After selecting the best performing fluorophore, its performance has been analyzed by fluorescence titrations measurements with the target molecules, obtaining in all cases a good fluorescence quenching. The fluorophore has been used to synthesize three peptides, testing their performance by fluorescence titrations and comparing their performance with that of the fluorophore alone. As for the third approach, two peptides have been synthesized, containing both a fluorescent moiety -fluorescein in one case, EDANS in the other- and the non-natural amino acid para-amino phenylalanine, capable of providing both π-π stacking interactions with phenols but also of reacting in covalent diazo-coupling reaction, forming red-colored diazo-coupling derivatives upon reaction with tyrosol. The peptides have been tested in both the non-covalent and covalent approach.

Lo scopo del progetto di dottorato è stato lo sviluppo di elementi di riconoscimento per il rilevamento di composti fenolici del caffè – in particolare acido clorogenico (CGA) e acido caffeico - e olio d'oliva – in particolare idrossitirosolo e tirosolo - per scopi di controllo qualità. L'obiettivo è stato quello di sviluppare strategie covalenti per il monitoraggio di molecole target (TM), sfruttando tecniche ottiche (assorbanza e fluorescenza) per la trasduzione del segnale. Le tre reazioni sfruttate sono state: -formazione di pigmenti verdi di triidrossibenzacridina (TBA); -formazione di esteri boronici; -reazione di diazo-coupling. La formazione del pigmento di TBA è una reazione che coinvolge i gruppi amminici primari e gli esteri dell'acido caffeico, come il CGA, che porta alla formazione di composti verdi. La reazione è stata inizialmente studiata sull'aminoacido lisina e CGA, utilizzandola per quantificare il target sia all'endpoint della reazione (dopo 24 ore) che lavorando in modalità cinetica, monitorando i primi 15 minuti di reazione, ottenendo ottimi risultati. La reazione è stata poi applicata alla sintesi di peptidi contenenti l'aminoacido lisina: per uno di essi si è potuta ottenere una prestazione migliorata rispetto all'aminoacido di partenza. La reazione è stata applicata anche alla sintesi di film polimerici contenenti monomeri amminici in grado di formare pigmenti di TBA con CGA: dopo aver testato la reattività di diverse composizioni polimeriche, quella migliore è stata utilizzata per confrontare le prestazioni nella quantificazione CGA della strumentazione di laboratorio e di diversi dispositivi portatili, ottenendo risultati promettenti per questi ultimi. Inoltre, sono state studiate nuove proprietà di fluorescenza del pigmento TBA. Considerando la reazione degli acidi boronici, l'obiettivo era quello di avere come target particolari composti orto-difenolici in grado di formare esteri boronici ciclici stabili. A tale scopo sono stati testati due fluorofori contenenti una funzione acido boronica e in grado di modulare la loro fluorescenza in seguito al legame delle molecole bersaglio. Dopo aver selezionato il fluoroforo più performante, le sue prestazioni sono state analizzate mediante misure di titolazioni di fluorescenza con le molecole bersaglio, ottenendo in tutti i casi un buon quenching della fluorescenza. Il fluoroforo è stato utilizzato per sintetizzare tre peptidi, testandone le prestazioni mediante titolazioni di fluorescenza e confrontandole con quelle del solo fluoroforo. Per quanto riguarda il terzo approccio, sono stati sintetizzati due peptidi, contenenti sia una porzione fluorescente -fluoresceina in un caso, EDANS nell'altro- sia l'amminoacido non naturale para-ammino-fenilalanina, in grado di stabilire interazioni di π-π stacking con fenoli ma anche di reagire nella reazione covalente di diazo-coupling, formando derivati di diazo-coupling di colore rosso dopo la reazione con il tirosolo. I peptidi sono stati testati sia nell'approccio non covalente che in quello covalente.