Comprendere la celiachia a risoluzione di singole cellule

Celiac disease (CD) is one of the most common chronic lifelong diseases, with a prevalence of 1% in the general population. A triad of factors (genetic predisposition, gluten and environmental factors) is involved in the pathogenesis of celiac disease that is not yet fully understood. Recent discoveries made with single cell RNA sequencing (scRNA-seq) have significantly improved our understanding of the human intestine, both in normal conditions and also across the spectrum of gut diseases. To study celiac disease with a scRNA-seq approach could provide new insights into the pathogenesis of celiac disease. The aims of the project were: (1) how to manipulate intestinal biopsy samples to generate single-cell RNA sequencing libraries; (2) generation of single-cell libraries from intestinal biopsies from pediatric patients undergoing esophagogastroduodenoscopy for suspected celiac disease or other gastrointestinal disorders; (3) bioinformatic analysis of single cells data to identify all types of intestinal cells and identify differences between celiac patients and controls. This study was performed using intestinal biopsy samples from pediatric patients. The GEXSCOPE kit (Singleron Biotechnologies) was used to generate the scRNA-seq libraries. The libraries generated were then sequenced using the Illumina platform, and the raw data obtained were analyzed using the Celescope (Linux) and Seurat (RStudio) packages. For the first objective, a pilot study was conducted. Four pediatric subjects were enrolled and divided into two groups each one including 1 control and 1 CD. Intestinal samples were processed after storage in a preservation fluid or immediately after collection. Single cell libraries were successfully generated from all patients. However, after sequencing, quality control analysis revealed: ➢ High mitochondrial RNA concentration and consequently low-quality scRNA-seq data in stored samples. ➢ Top-notch quality scRNA-seq data in fresh samples. This indicates that sample processing time is a crucial factor in obtaining high-quality scRNA-seq data from intestinal biopsy samples. Therefore, the 2 samples processed after storage were excluded from the study. For this project, single-cell libraries were generated from fresh intestinal biopsy samples from 5 celiac patients e 5 controls. After sequencing and quality control step top-notch quality data from 70.000 single cells were included in the final dataset. The cluster analysis identified 21 cell types, which were found in all patients. A significant difference in cell types percentage was observed between the groups: celiac patients compared to controls showed an increase in the number of immune cells and a decrease in the number of epithelial cells. Finally, the cell-cell communication analysis between the various cell types was performed in both celiac patients and controls. This analysis revealed a high communication in the immune intestinal compartment of celiac patients, in comparison to controls in which cell communication appears to be homogeneous for all cell types.

La celiachia (CD) è una delle malattie croniche permanenti più comuni, con una prevalenza dell'1% nella popolazione generale. Una triade di fattori (predisposizione genetica, glutine e fattori ambientali) è coinvolta nella patogenesi della celiachia, che non è ancora del tutto chiara. Le recenti scoperte effettuate con il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) hanno migliorato significativamente la nostra comprensione dell'intestino umano, sia in condizioni normali che nell'ambito dello spettro delle malattie intestinali. Lo studio della celiachia con un approccio scRNA-seq potrebbe fornire nuove informazioni sulla patogenesi della celiachia. Gli obiettivi del progetto erano: (1) come manipolare i campioni di biopsia intestinale per generare librerie di sequenziamento dell'RNA a singola cellula; (2) generazione di librerie a singola cellula da biopsie intestinali di pazienti pediatrici sottoposti a esofagogastroduodenoscopia per sospetta celiachia o altri disturbi gastrointestinali; (3) analisi bioinformatica dei dati delle singole cellule per identificare tutti i tipi di cellule intestinali e identificare le differenze tra pazienti celiaci e controlli. Questo studio è stato condotto utilizzando campioni di biopsia intestinale provenienti da pazienti pediatrici. Il kit GEXSCOPE (Singleron Biotechnologies) è stato utilizzato per generare le librerie scRNA-seq. Le librerie generate sono state quindi sequenziate utilizzando la piattaforma Illumina e i dati grezzi ottenuti sono stati analizzati utilizzando i pacchetti Celescope (Linux) e Seurat (RStudio). Per il primo obiettivo è stato condotto uno studio pilota. Sono stati arruolati quattro soggetti pediatrici, suddivisi in due gruppi, ciascuno comprendente 1 controllo e 1 CD. I campioni intestinali sono stati trattati dopo la conservazione in un liquido di conservazione o immediatamente dopo la raccolta. Le librerie a cellula singola sono state generate con successo da tutti i pazienti. Tuttavia, dopo il sequenziamento, l'analisi di controllo qualità ha rivelato: ➢ Elevata concentrazione di RNA mitocondriale e, di conseguenza, dati scRNA-seq di bassa qualità nei campioni conservati. ➢ Dati scRNA-seq di ottima qualità nei campioni freschi. Ciò indica che il tempo di elaborazione dei campioni è un fattore cruciale per ottenere dati scRNA-seq di alta qualità dai campioni di biopsia intestinale. Pertanto, i 2 campioni elaborati dopo la conservazione sono stati esclusi dallo studio. Per questo progetto, sono state generate librerie di singole cellule da campioni freschi di biopsia intestinale provenienti da 5 pazienti celiaci e 5 controlli. Dopo la fase di sequenziamento e controllo qualità, nel dataset finale sono stati inclusi dati di altissima qualità provenienti da circa 70.000 singole cellule. L'analisi dei cluster ha identificato 21 tipi cellulari, che sono stati riscontrati in tutti i pazienti. È stata osservata una differenza significativa nella percentuale dei tipi cellulari tra i gruppi: i pazienti celiaci rispetto ai controlli hanno mostrato un aumento del numero di cellule immunitarie e una diminuzione del numero di cellule epiteliali. Infine, è stata eseguita l'analisi della comunicazione cellula-cellula tra i vari tipi cellulari sia nei pazienti celiaci che nei controlli. Questa analisi ha rivelato un'elevata comunicazione nel compartimento immunitario intestinale dei pazienti celiaci, rispetto ai controlli in cui la comunicazione cellulare appare omogenea per tutti i tipi cellulari.